Northern雜交試驗指導手冊(3)
試驗程序1.在純凈工作臺上將5ml含AP的LB液體培養基加入到一10~15ml通氣良好的試管中，然后將前述經鑒定含有目的 DNA片斷的轉化細菌接種其中，37℃下振蕩培養過夜。2.取1.5ml培養物置于一微量離心管中，在4℃下12000rpm離心2min.，棄去上清液，使細菌沉淀盡可能干燥。3.將細菌沉淀重懸于100μl溶液I中，劇烈振蕩后加入200μl新配制的溶液II，蓋緊離心管口，將其快速顛倒5次（切勿振蕩），再加入150μl在冰上預冷的溶液III，蓋緊離心管口，將其倒置后輕輕地振蕩使溶液III在粘稠的裂解物中分散均勻，再將離心管置于冰上3~5min.。4.在4℃下12000rpm離心5min.，將上清液移至另一離心管中。5.加入等量酚∶氯仿（1∶1），振蕩混勻，在4℃下12000rpm離心2min.，將上清液轉入另一離心管中。6.加入二倍體積95%乙醇，振蕩混勻，室溫放置20min.，在 4℃下12000rpm離心5min.......閱讀全文
Northern雜交試驗指導手冊（3）
A． 載體選擇為了獲得能夠在體外轉錄RNA探針的DNA模板，其克隆載體必須帶有可供選擇的特異轉錄啟動子，同時，為了獲得理想的Northern雜交試驗結果，載體選擇帶有兩種不同類型而方向相反啟動子的載體，以便在RNA探針制備時同時得到兩條鏈的轉錄探針。常用的這類載體有：pGEM-3/pGEM-4 (
Northern雜交試驗指導手冊(3)
試驗程序1.在純凈工作臺上將5ml含AP的LB液體培養基加入到一10~15ml通氣良好的試管中，然后將前述經鑒定含有目的 DNA片斷的轉化細菌接種其中，37℃下振蕩培養過夜。2.取1.5ml培養物置于一微量離心管中，在4℃下12000rpm離心2min.，棄去上清液，使細菌沉淀盡可能干燥。3.將細菌
Northern雜交試驗指導手冊
Northern雜交試驗指導手冊DIG標記的Northern雜交試驗指導一、 RNA提取方法一、改良異硫氰酸胍提取法試劑及其配制異硫氰酸胍變性液：貯存液－在含484ml 水（經DEPC處理）, 17.6ml 0.75mol/L檸檬酸鈉（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入25
Northern雜交試驗指導手冊(1)
一、RNA提取方法一、改良異硫氰酸胍提取法試劑及其配制異硫氰酸胍變性液：貯存液－在含484ml 水（經DEPC處理）, 17.6ml 0.75mol/L檸檬酸鈉（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g異硫氰酸胍，加熱至60~65℃并持續攪拌使之充分溶解。貯存液室溫保存備
Northern雜交試驗指導手冊(2)
RNA樣品質量分析：完整的總RNA樣品應呈現出三條條帶，分別為28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA條帶的亮度應約為18S rRNA條帶亮度的2倍，這表明RNA樣品比較完整，基本無降解。如果兩條帶的亮度反過來，則說明RNA樣品已發生降解。如果在點樣槽內或槽附近有
Northern雜交試驗指導手冊(4)
8.將樣品測試條和對照測試條按下列順序在上述準備的溶液中浸漬處理，兩步驟直接讓多余的溶液滴在吸水紙上。①. 封閉， 2min.→②. 抗體結合， 3min.→①. 封閉， 1min.→③. 洗膜, 1min. →④. 平衡， 1min. →⑤. 顯色反應（黑暗），5－30min.9.顯色反應30mi
Northern雜交試驗指導手冊(5)
?E.雜交建議雜交條件：探針濃度50~100ng/ml，溫度68℃過夜。1.將印跡膜置于裝有預雜交液的雜交袋中（每100cm2膜20ml預雜交液），封好雜交袋，在設定的雜交溫度下預雜交至少1小時。2.將探針在沸水浴中變性10min.(探針一經變性，立即使用)，用預雜交液稀釋成設定濃度。3.將雜交袋中
Northern雜交試驗指導手冊（6）－Northern－印跡雜交
A． 探針準備DIG標記的RNA探針與DNA探針相比，顯示較強的雜交信號和較地的非特異性背景，因此，只要可能選用RNA探針可以比DNA探針獲得更好的雜交結果。如果必須使用DNA探針，建議使用高SDS雜交緩沖液或DIG Easy Hyb以減少背景。在正式雜交試驗之前，優化雜交探針濃度是避免顏色背景所必
Northern雜交試驗指導手冊（1）－RNA提取
方法一、改良異硫氰酸胍提取法試劑及其配制異硫氰酸胍變性液：貯存液－在含484ml 水（經DEPC處理）, 17.6ml 0.75mol/L檸檬酸鈉（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g異硫氰酸胍，加熱至60~65℃并持續攪拌使之充分溶解。貯存液室溫保存備用（不超過3個
Northern雜交試驗指導手冊（7）－雜交結果檢測
方法一、化學發光檢測試劑及其配制：洗膜緩沖液：100mmol Maleic acid150mmol NaCl0.3%(v/v) Tween20pH 7.5Maleic acid緩沖液：100mmol Maleic acid150mmol NaClpH 7.5封閉液：5% (w/v) SDS17mmo
Northern雜交試驗指導手冊（5）－RNA探針制備
五、RNA探針制備（根據the DIG system user's guide）A． 地高辛標記的體外轉錄試劑及其配制（試劑盒提供）：10× NTP標記混合物：in Tris-HCl (pH 7.5)10mmol ATP10mmol CTP10mmol GTP6.5mmol UTP3.5mm
Northern雜交試驗指導手冊（2）－RNA質量檢測
二、RNA質量檢測提取的RNA需要對其質量和數量進行檢測。實驗室常用的方法有紫外吸收值檢測和電泳檢測兩種。方法一、紫外吸收檢測試劑：TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。dH2O試驗程序1．預熱紫外分光光度計10～20min.。2．取兩個1ml的狹縫石英杯，一個裝入1ml
Northern雜交試驗指導手冊（4）－模板DNA的制備
A．質粒DNA的小量提取試劑及其配制含AP的LB液體培養基TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)1mmol/L EDTA (pH 8.0)溶液I： 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)10mmol/L EDTA50mmol/L 葡萄糖高壓滅菌15min.后，4
總RNA提取與Northern雜交（3）
第二天：將上述物品揭開，將膠正面朝下，膜正面朝上，用鉛筆作好標記。將膠浸泡在EB中1-2分鐘，用DEPC H2O清洗，將膜放在濾紙上面，夾好，4度下保存，或者直接進行預雜交。UV雜交（有助于RNA結合到膜上面）。五、預雜交和雜交預雜交和雜交 buffer： 100ul20×SSC 25ml （5×S
Northern雜交
實驗方法原理 轉移并固定到膜上的 RNA 樣品可以與特異的探針雜交，從而用來對所感興趣的 RNA 進行定位。視實驗人員和條件的差異，可以從多種方法中選擇任意一種來標記和檢測探針。用抑制非特異吸收探針的封閉試劑處理膜之后，在適于探針和固定的靶 RNA 雜交的條件下將膜同探針孵育，而后廣泛洗
Northern雜交
轉移并固定到膜上的 RNA 樣品可以與特異的探針雜交，從而用來對所感興趣的 RNA 進行定位。視實驗人員和條件的差異，可以從多種方法中選擇任意一種來標記和檢測探針。用抑制非特異吸收探針的封閉試劑處理膜之后，在適于探針和固定的靶 RNA 雜交的條件下將膜同探針孵育，而后廣泛洗膜以去除非特異結合的探針，
Northern雜交
Northern雜交1．在10~20 ml?預雜交液中68℃溫育膜2h。2．若使用雙鏈探針，在100℃下加熱32P標記的雙鏈DNA 5 min，使之變性，然后迅速移至冰水中冷卻。3．把變性的或單鏈放射性標記的探針直接加到預雜交液中，在合適的溫度下繼續溫育12~16h。4．雜交后，將膜從塑料袋中取出，
Northern雜交
實驗概要本實驗介紹了Northern雜交的基本流程。主要試劑液氮，TRIzol ?(Invitrogen)，DEPC水，氯仿，異丙醇，70%酒精，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，水飽和酚(PH4.3)，無水乙醇，NaOAc，抽提緩沖液(0.02M ?NaOAc，1 mM EDTA，0.5% SD
Northern雜交
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 轉移并固定到膜上的 RNA 樣品可以與特異的探針雜交，從而用來對所感興趣的 RNA 進行定位。視實驗人員和條件的差異，可以從多種方法中選擇任意一種來標記和檢測探針。用抑制非特異吸收探針的封閉試劑處理膜之后，在適于探針和固定的
Northern－Blotnorthern雜交
Northern BlotPreparation of Formaldehyde Agarose GelThe gel conditions (1% agarose, 1X MOPS, 6.3% formaldehyde) are designed for ~4 hours of electroph
Northern雜交技術
經乙二醛和二甲基亞砜變性處理后進行的RNA電泳這一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。?含有乙二醛－DMSO的凝膠比含有甲醛的凝膠更難于進行電泳，因為前者泳動速率較慢而且需將電泳液時行循環以避免電泳過程中形成過高的H＋梯度。盡管上述兩種凝膠具有近乎相等的分辨率（Miller，
OsAGAP的Northern雜交
實驗概要本實驗參照Sambrook等(1989)的方法進行轉膜，雜交。實驗步驟1. RNA樣品的電泳轉膜將適量的瓊脂糖溶于水，微波爐加熱使之完全溶解，并冷卻至60℃；將甲醛溶液、瓊脂糖水溶液、5X甲醛凝膠電泳緩沖液按1:3.5:1.1比例混合，灌制凝膠。將不同材料的上樣量調成一致，均為35ug，與樣
分子雜交技術Northern雜交的簡介
Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結構,保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉移相同的方法將RNA轉移到硝
southern雜交與northern雜交的區別
研究的對象不同。southern主要的對象是DNA，northern研究的對象是RNA。Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制性內切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上。
southern雜交與northern雜交的區別
研究的對象不同。southern主要的對象是DNA，northern研究的對象是RNA。Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制性內切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上。
組織印跡的Northern雜交
組織印跡的Northern雜交1）硝酸纖維素膜或尼龍膜上的組織印跡1．在塑料板上放置兩層Whatman 1號濾紙，在濾紙上方放上一張普通紙，然后鋪上一層尼龍膜。2．用雙面刀片從植物組織如大豆的莖上切取一塊切片（厚度約為1mm）。如果組織表面是濕的，則在Kimwipes紙上輕輕吸干或先用蒸餾水洗滌幾秒
分子雜交——Northern基因檢測
實驗概要Northern雜交采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開來，隨后將其原位轉移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標記的DNA或RNA探針，依據其同源性進行雜交，最后進行放射自顯影（或化學顯影），以目標RNA所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強度則
Northern雜交分析操作步驟
【操作】1．RNA的提取見前。2．變性膠的制備：取瓊脂糖0.2g，加入 DEPC H2O 12.4ml，加熱熔化，冷卻至 60℃時加入5×甲醛凝膠電泳緩沖溶液4.0 、37%甲醛3.6ml、混勻、制膠。待膠凝固后，置于1×甲醛凝膠電泳緩沖溶液中預電泳5min。3．樣品制備 取總RNA4.5 ，加入5
Northern雜交步驟和過程
Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結構,保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉移相同的方法將RNA轉移到硝酸纖
分子雜交技術Northern雜交的操作步驟
(1)RNA經變性電泳完畢后,可立即將乙醛酰RNA轉移至硝酸纖維素濾膜上。轉移方法與轉移DNA的方法相似。 (2)轉移完畢后 ,以6×SSC溶液于室溫浸泡此膜5分鐘,以除去瓊脂糖碎片。 (3)將該雜交膜夾于兩張濾紙中間,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小時。 (4) 用下列兩種溶液之一進行