Cell子刊突破：無需克隆的CRISPR新技術
來自荷蘭Hubrecht研究所和烏特勒支醫學中心（UMC Utrecht）、麻省理工學院的研究人員稱，他們開發出了一種自身克隆CRISPR/Cas9(scCRISPR)技術，可以繞開基因編輯過程中所有的克隆步驟，在數小時內完成CRISPR/Cas9介導基因突變及位點特異性轉基因敲入。他們的研究成果發布在10月29日的《Stem Cell Reports》雜志上。 CRISPR序列源于原核生物的一種獲得性免疫系統，協同Cas（CRISPR-associated）蛋白家族參與抵抗噬菌體或其他病毒的二次感染，廣泛存在于細菌和古細菌中。目前已發現三種不同類型的CRISPR/ Cas系統。 當前，研究人員已將II型CRISPR/ Cas系統——CRISPR/ Cas9系統改造成為了一種高效的新型基因組編輯工具，它能夠以一種位點特異性方式在培養細胞和整個生物體中實現定向修飾（突變、刪除、添加、激活、抑制）特定基因序列。現已在人類、小......閱讀全文
－Cell子刊突破：無需克隆的CRISPR新技術
來自荷蘭Hubrecht研究所和烏特勒支醫學中心（UMC Utrecht）、麻省理工學院的研究人員稱，他們開發出了一種自身克隆CRISPR/Cas9(scCRISPR)技術，可以繞開基因編輯過程中所有的克隆步驟，在數小時內完成CRISPR/Cas9介導基因突變及位點特異性轉基因敲入。他們的研究成
粘粒和質粒克隆的純化實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 質粒 試劑、試劑盒
粘粒和質粒克隆的純化實驗
文庫一旦包裝就應該盡快進行擴增，它可以大大增加文庫的拷貝數，但在擴增時由于克隆的生長速率不同，文庫的組成可能會出現某種潛在的改變。這種文庫克隆組成比率的變化可以通過把文庫克隆預吸附到細菌上并使用一種高密度鋪平板和短期培養的方法而盡量減少。實驗材料質粒試劑、試劑盒LB抗生素儀器、耗材涂布棒硝酸纖維濾膜
粘粒和質粒克隆的純化實驗
實驗材料 質粒試劑、試劑盒 LB抗生素儀器、耗材 涂布棒硝酸纖維濾膜實驗步驟 1. ?通過原位雜交檢測硝酸纖維索濾膜上影印菌落。2. ?用無菌的牙簽挑出陽性克隆，接種到含適當抗生素的1 ml 冷的LB培養基中，保存在4℃抑制細菌生長。3. ?取1~25 μl 菌懸液涂布在含有相同抗生素的平板上，37
在質粒載體中進行定向克隆實驗
大多數常用質粒都含有可被不同內切酶識別的多克隆位點。由于可供選擇的克隆位點很多 [ 如 Invitrogen 公司的 PSE280 質粒的克隆位點有 46 個之多，而且還可以設計含有更多克隆位點的多聚接頭（Brosius 1992 ) ]，因此一般來說總是能夠找到一個帶有與某一特定外源 DNA 片段
克隆化酵母DNA的操作實驗——穿梭質粒
實驗材料酵母實驗步驟1. ?構建其必需基因的染色體拷貝已被破壞的單倍體菌株，及帶有完整的必需基因和URA3選擇標志的YEp質粒。2. ?將必需基因亞克隆到YCp載體（帶有URA3以外的選擇標志），取約10~20 μg 用羥胺或其他技術進行誘變。3. ?轉化至步驟1的菌株中，在添加了尿嘧啶的省卻成分平
質粒克隆載體的設計和構建的原則
①選擇合適的出發質粒出發質粒也叫親本質粒，它應含有質粒克隆載體必備的元件，如復制起始位點、選擇標記基因、克隆位點、啟動子和終止子等。②正確獲得構建質粒克隆載體的元件一般采用限制性核酸內切酶切割出質粒DNA分子，獲得含有某種元件的DNA片段，還可以采用PCR技術從靶DNA中擴增出含某種元件的特異性DN
在質粒載體中進行定向克隆實驗
實驗方法原理 大多數常用質粒都含有可被不同內切酶識別的多克隆位點。由于可供選擇的克隆位點很多 [ 如 Invitrogen 公司的 PSE280 質粒的克隆位點有 46 個之多，而且還可以設計含有更多克隆位點的多聚接頭（Brosius 1992 ) ]，因此一般來說總是能夠找到一個帶有與某一
在質粒載體中進行定向克隆實驗
在質粒載體中進行定向克隆實驗 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 大多數常用質粒都含有可被不同內切酶識別的多克隆位點。由于可供選擇的克隆位點很多 [ 如 Invitrogen 公司
在質粒載體中進行平末端片段的克隆
在質粒載體中進行平末端片段的克隆1．分別設立兩個反應，用適當的限制性內切核酸酶消化1~10μg質粒DNA和外源DNA片段，使它們能產生平末端。2．苯酚：氯仿抽提與乙醇沉淀法純化出已被消化的載體和外源DNA片段。3．分別用TE（pH 8.0）重新溶解純化出的兩種DNA沉淀，使終濃度為100 ng/ml
克隆化酵母DNA的操作實驗——質粒缺口修復
實驗材料酵母實驗步驟1. ?將目的基因亞克隆到YRp質粒，通過基因內的兩個限制性位點在基因中創造一個缺口區，在缺口兩側留下≥100~250 bp 的同源區，凝膠電泳純化質粒骨架大片段。?2. ?用1~10 μg?缺口質粒DNA轉化待拯救的含突變等位基因的酵母菌株，通過YRp質粒上的選擇基因進行選擇，
在質粒載體中進行平末端片段的克隆
1．分別設立兩個反應，用適當的限制性內切核酸酶消化1~10μg質粒DNA和外源DNA片段，使它們能產生平末端。2．苯酚：氯仿抽提與乙醇沉淀法純化出已被消化的載體和外源DNA片段。3．分別用TE（pH 8.0）重新溶解純化出的兩種DNA沉淀，使終濃度為100 ng/ml。?假設1 bp相當于660 D
新技術可高效誘導單克隆抗體
抗體藥物作為生物技術產業的關鍵驅動力，能安全有效地對癌癥、自身免疫病和感染性疾病等進行靶向治療，該藥物在2012年創下全球645.7億美元的銷售額，占生物制藥51.8%的份額。目前抗體藥物的市場需求量仍在攀升，預計到2015年，抗體藥物銷售額有望達980億美元左右。業內人士認為，隨著疾病譜變化，
用克隆環分離細胞克隆
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 將集落在瓷制克隆環、玻璃環、PTFE 環或者不銹鋼環中用胰蛋由酶消化后移至24 孔或12 孔板中的一個孔或者直接種于 25 cm2 的培養瓶內。 實驗材料
用克隆環分離細胞克隆
實驗方法原理將集落在瓷制克隆環、玻璃環、PTFE 環或者不銹鋼環中用胰蛋由酶消化后移至24 孔或12 孔板中的一個孔或者直接種于 25 cm2?的培養瓶內。實驗材料胰蛋白酶試劑、試劑盒硅油儀器、耗材克隆培養環巴氏吸管生長培養基多孔板無菌鑷移液器粗頭筆實驗步驟1. 觀察細胞克隆，用氈制粗頭筆或 Nik
用克隆環分離細胞克隆
實驗方法原理 將集落在瓷制克隆環、玻璃環、PTFE 環或者不銹鋼環中用胰蛋由酶消化后移至24 孔或12 孔板中的一個孔或者直接種于 25 cm2 的培養瓶內。實驗材料 胰蛋白酶試劑、試劑盒 硅油儀器、耗材 克隆培養環巴氏吸管生長培養基多孔板無菌鑷移液器粗頭筆實驗步驟 1. 觀察細胞克隆，用氈制粗頭筆
單克隆與克隆的區別
無性增殖（分裂、生殖）叫做克隆，克隆是一個很大的范圍，單克隆是指的單克隆抗體，它由融合的細胞得來。是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。“單”和“克隆”要分開看，克隆是因為它是無性增殖來的，通常是一種人工誘導的無性生殖方式或者自然的無性生殖方式（如植物）。是原來細胞的基因的
用克隆環分離細胞克隆
實驗方法原理將集落在瓷制克隆環、玻璃環、PTFE 環或者不銹鋼環中用胰蛋由酶消化后移至24 孔或12 孔板中的一個孔或者直接種于 25 cm2 的培養瓶內。實驗材料胰蛋白酶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?試劑、試劑盒
在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗
在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 克隆平末端的目的片段時，為最大量地獲得“正確”的連接產物，載體和目的 DNA 在連接反應中的比例必須適當。
外源DNA片段在質粒載體中的克隆實驗
克隆法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA的純化處理后用于連接反應；選擇克隆載體pUC18多克隆位點上
在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗
實驗方法原理 克隆平末端的目的片段時，為最大量地獲得“正確”的連接產物，載體和目的 DNA 在連接反應中的比例必須適當。每一重組體中外源 DNA 的連接方向和插入數量都必須用限制酶酶切圖譜分析或其他方法加以鑒定。作為一般規律，如果連接反應中質粒和目的 DNA 摩爾數相等，而且 DNA 的
外源DNA片段在質粒載體中的克隆實驗
NA重組技術包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內容。主要用于（1）外源性基因轉染；（2）對外源性基因的轉化分離。實驗方法原理限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA的純化處理后用于連接反應；
在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗
克隆平末端的目的片段時，為最大量地獲得“正確”的連接產物，載體和目的 DNA 在連接反應中的比例必須適當。每一重組體中外源 DNA 的連接方向和插入數量都必須用限制酶酶切圖譜分析或其他方法加以鑒定。作為一般規律，如果連接反應中質粒和目的 DNA 摩爾數相等，而且 DNA 的總濃度少于 100 μg/
外源DNA片段在質粒載體中的克隆實
實驗方法原理?限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA的純化處理后用于連接反應；選擇克隆載體pUC18多克隆位點上相應的限制性內切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現外源片段的克隆。實驗材料?DNA片段PUC18試劑
質粒克隆載體的設計和構建過程遵循的原則
①選擇合適的出發質粒 出發質粒也叫親本質粒,它應含有質粒克隆載體必備的元件,如復制起始位點、選擇標記基因、克隆位點、啟動子和終止子等。 ②正確獲得構建質粒克隆載體的元件 一般采用限制性核酸內切酶切割出質粒DNA分子,獲得含有某種元件的DNA片段,還可以采用PCR技術從靶DNA中擴增出含某種
簡述分子克隆化克隆的選擇
①直接篩選：有些載體帶有可辨認的遺傳標記，能有效地將重組分子與本底區分。例如：有些λ噬菌體攜帶外源基因后形成的噬菌斑就會從原來的混濁變為清亮；還有些載體分子攜帶外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍色變為無色；有些λ噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段后便能侵染乙菌，
單克隆抗體的克隆方法
經過抗體測定的陽性孔，可以擴大培養，進行克隆，以得到單個細胞的后代分泌單克隆抗體。克隆的時間一般說來越早越好。因為在這個時期各種雜交瘤細胞同時旺盛生長，互相爭奪營養和空間，而產生指定抗體的細胞有被淹沒和淘汰的可能。但克隆時間也不宜太早，太早細胞性狀不穩定，數量少也易丟失。克隆化的陽性雜交瘤細胞，經過
湖北農科院用CRISPR制備基因敲除克隆豬
來自湖北省農科院畜牧獸醫研究所、河南科技大學和中科院水生生物研究所的研究人員，用CRISPR/Cas9系統和Cre/LoxP，敲除了豬初生細胞中肌生成抑制蛋白（MSTN）的一個等位基因，制備了無選擇標記的MSTN基因敲除克隆豬。相關研究結果發表在8月17日的《Scientific Reports
基因克隆
外源DNA和質粒載體的連接反應?外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間?形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交
DNA克隆
DNA克隆（主要內容如下）·?????????General Procedure·?????????PCR Cloning·?????????Subcloning·?????????ET Cloning·?????????Vector Preparation·?????????Ligation Re