實驗概要
蚜蟲胞內共生菌研究的關鍵環節是共生菌的脫除及體外培養,脫共生效果的準確判斷是保證試驗結果正確的重要因素。本研究的目的是尋找一種方便有效的脫共生效果的鑒定方法,為進一步研究蚜蟲與其胞內共生菌的關系提供有效的檢測手段。
主要試劑
利福平(Rifampicin,Serva產品);鹽酸金霉素(Chlortetracycline HCl),BIB分裝;氯霉素(Chloraomycetin),Amresco分裝;鹽酸土霉素(Oxytetracycline HCl)BIB分裝;青霉素G鉀鹽(Penicillin-G K Salt),BIB分裝;硫酸鏈霉素(Streptomycinsulfate),BIB分裝。以上抗生素均為化學純研究專用抗生素。
實驗材料
黑豆蚜用盆栽蠶豆(Vicia faba L.)苗飼養,溫度23-25℃,光周期16:8。
實驗步驟
1. 抗生素處理方法
將2周大的蠶豆苗用蒸餾水沖洗干凈,涼干表面水分后,將其根部浸泡在濃度為0.2mg/ml的抗生素溶液中,24小時后接0日齡若蚜,2天后將所有蚜蟲轉入正常植株飼養。處理5天和10天后分別取樣,抽提DNA。
2. DNA抽提
將正常蚜蟲及抗生素處理過的蚜蟲于裂解緩沖液中勻漿,用蛋白酶 K處理過夜后,按照常規的酚-氯仿法進行DNA抽提。
3. 引物設計及PCR反應
利用Shigenobu等(2000)報導的巴克納氏菌基因組中rrl-aroE基因序列和Primer Premier 5.0軟件設計引物,從中選取一對S:5'-gtc ggc tca tca cat cct3'和A:5'-ttc cgt ctg tat tat ct cct3’進行PCR反應,擴增片段長度為799bp。PCR反應條件為:94℃變性2min后,進行35循環,每個循環為94℃變性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸1分鐘。
4. 電鏡觀察
選取處理7天后的正常蚜蟲以及利福平處理過的蚜蟲,經戊二醛固定液固定后進行電鏡切片觀察。