照高效液相色譜法(通則0512)測定。
色譜條件與系統適用性試驗
采用十八烷基硅烷鍵合硅膠填充色譜柱,柱長250mm,柱直徑4.6mm,粒度5μm。流動相為18.2mmol/L磷酸鹽緩沖液,0.1%異丙醇溶液(pH 2.0～2.5);柱溫40℃;流速為每分鐘1.0ml;樣品池溫度為室溫;運行時間50分鐘;紫外檢測器檢測波長為210nm。取5.0mmol/L枸櫞酸離子溶液20μl,注入色譜柱,記錄色譜圖,拖尾因子按枸櫞酸離子色譜峰測定應為0.95～1.40。
測定法
精密稱取經減壓干燥至恒重的枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)0.735g,置100ml量瓶中,用超純水溶解并稀釋至刻度。精密量取5.0ml、10.0ml、15.0ml,分別置25ml量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,即得相應的5.0mmol/L、10.0mmol/L、15.0mmol/L枸櫞酸離子對照品溶液。分別精密量取20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖;另精密量取供試品溶液1ml,置15ml離心管中,精密加1.5%磺基水楊酸4ml,混勻,室溫靜置2小時以上,以每分鐘3000轉離心10分鐘,取上清液,同法測定。
以對照品溶液的枸櫞酸離子濃度對其相應的峰面積作直線回歸,求得直線回歸方程。計算供試品溶液枸櫞酸離子含量(mmol/L),再乘以相應的供試品稀釋倍數(5),即為供試品枸櫞酸離子含量(mmol/L)。
【附注】(1)根據供試品枸櫞酸離子含量,可適當調整枸櫞酸離子對照品溶液濃度。
(2)根據供試品蛋白質濃度,可適當調整沉淀劑磺基水楊酸的加入量。
(3)直線回歸相關系數應不低于0.999。