【目的】
保證免疫金標技術檢驗準確性
【本SOP適用范圍】
免疫金標技術
【原理】
氯化金分子在還原劑作用下聚合形成金顆粒，顆粒與顆粒之間因靜電作用而相互排斥，使其保持一個比較穩定的膠體狀態，故稱作膠體金。利用膠體金顆粒的高電子密度及其表面能結合生物大分子(如抗體、SPA、植物血凝素和刀豆蛋白A等)以 及具有一定顏色等特性，可用光鏡和電鏡對細胞內抗原進行定位、定性的研究。
【方法學分類】
1. 班點金免疫滲濾試驗 固相膜免疫測定中液體在微孔膜中穿過流出呈穿流形式，為斑點金免疫滲濾試驗(dot immunogold filtration assay，DIGFA)，亦有稱免疫金溶膠斑點法、滴金免疫測定法等。試驗單位為三層反應盒，第一層為過濾器(濾紙層)，第二層為反應膜(NC膜或MC膜)上點加有特異性抗原或抗體，第三層為吸水墊料，有稱此滲濾裝置為滴金反應板。
以雙抗體夾心法測dsDNA為例：試驗中將標本加在反應盒上，血清(標本)透過過濾層進入反應層，反應層上點有“一”字形抗IgG(或某種人血清蛋白作為試驗陽性對照)及“．”形被測物相應抗體，血清中抗原與反應層中抗體結合，其余無關蛋白等濾出膜片，加入金標記抗體試劑，反應膜上“一”字形及“．”形均顯紅色為試驗陽性，僅“一”形顯紅色為試驗陰性(試劑盒狀態良好)，“一”不顯色提示試劑盒質量不合格，需另取反應盒重做試驗。
試劑盒基本試劑成分有滴金反應板、金標記試劑及洗滌液。
2. 斑點金免疫層析試驗 固相膜免疫測定中液體通過毛細管作用在膜上向前移行呈橫流形式，為斑點金免疫層析試驗(dotimmunogoldchromatographyassay，DIGCA)。試驗單位為一濾膜條，自上而下分有多個層次。
如單克隆雙抗體法測HCG，濾膜條各區域分別為：吸水濾紙—固定有金標二抗的MC膜—固定有抗β-HCG抗體的MC膜—金標記抗。α-HCG玻璃纖維—吸尿玻璃纖維。試驗中將濾膜條浸入被測尿液或滴加尿液，尿液在毛細管作用下向試紙條上端緩緩移行，尿液將金標抗。α-HCG溶解并帶動它向前移動，結合尿中HCG至抗β-HCG抗體處形成復合物，并在抗β-HCG抗體固定處顯示膠體金特有紅色，提示試驗陽性。尿中無HCG時，溶解的抗α-HCG至固定有金標二抗的MC膜處顯示膠體金特有紅色(質控線條)，提示試驗陰性。
試劑盒基本單位僅有一濾膜條，只有一步操作。
3. 膠體金顆粒的制備
在氯化金溶液中加入不同的還原劑，可制備出不同大小的金顆粒。常采用檸檬酸、抗壞血酸和白磷。用這三種還原劑可分別制備出大、中、小三種主要膠體金顆粒。目前，有更多的實驗室僅以檸檬酸為還原劑，在檸檬酸還原氯化金時，加入不同量的單寧酸即可獲得大小不同的金顆粒，所制備金顆粒的大小非常一致。
[1] 以抗壞血酸為還原劑制備10～15nm直徑的膠體金(Au l5) 在一個洗凈烤干的250 ml容量的三角燒瓶中，加入20ml三蒸去離子水(3DW)、l ml 0.1 mol/L K2CO3和l ml％氯化金水溶液于冰浴中混勻，立即加入l ml 0.7％ 抗壞血酸，并充分搖動至溶液呈紫紅色，加3DW至100ml，100℃水浴5min后，溶液變成紅色，放室溫冷卻待用。
[2] 以檸檬酸為還原劑制備8～10 nm直徑的膠體金(Au l0) 125 ml 3 DW煮沸后加入1％ 檸檬酸7.5 ml，再煮沸5 min，迅速加入1.25 ml％氯化金溶液，100℃水浴15 min，溶液置室溫待用。
[3] 以檸檬酸為還原劑制備5—6 nm直徑膠體金(Au 6) 將l ml氯化金加入100 ml 3DW中煮沸，快速加進2．45ml檸檬酸—單寧酸的混合液(2 ml 1％ 檸檬酸三鈉、0.45 ml 1％ 單寧酸)，繼續煮沸5 min，放室溫待用。
[4] 白磷為還原劑制備5 nm直徑的膠體金(Au 5) 將120 ml 3DW、1.5 ml％氯化金和2.7 ml 1 mol/L K2CO3，混合，緩慢攪拌中快速加進l ml白磷一乙醚溶液，室溫輕攪拌15 min，100℃水浴30 min后放室溫待用。
膠體金制備一般需在中性pH(7.2左右)條件下進行，也可在稍偏酸或稍偏堿的環境中進行。制備的膠體金其大小和形狀可在電鏡下觀察確定。一般膠體金溶液呈紅葡萄酒顏色，大顆粒膠體金是紫紅色。正常情況下，膠體金溶液應清澈而不含任何可見的沉淀或漂浮物，如溶液、試劑、瓶皿等不干凈。將造成如下結果：第一不能獲得預期大小的膠體金顆粒，第二將影響到下一步生物大分子的吸附過程和包被后膠體金的穩定性。因此，為了獲得滿意的膠體金，應選擇最純凈的各有關試劑和液體。如有條件，所有試劑最好經過超過濾處理，以除去其中的分子聚合體和可能混入的雜質塊。制備過程中所用的水以三蒸去離子水最合適，各類器皿均應嚴格清洗，盛膠體金的瓶皿先經過硅化則更為理想。膠體金顆粒在吸附生物大分子之前具有一定的穩定性，4℃可存放一周左右，如果經超過濾和透析處理后加0.002％ 疊氮鈉，能保存5個月左右。
4. 膠體金和生物大分子的結合
任何蛋白質都能結合到膠體金顆粒表面，膠體金和蛋白質結合后，并不影響蛋白質的反應性。
[1]生物大分子的準備 鹽類成分能影響膠體金的吸附能力，并使膠體金顆粒發生聚集，因此，生物大分子在包被金顆粒前，常需透析，使溶液無鹽或鹽的濃度極低，常用的透析液為0.003ml/L NaCI。
[2]膠體金顆粒的包被 以生物大分子包被膠體金顆粒時，首先需要確定其精確用量，即蛋白質完全包被膠體金所需蛋白質的最小劑量。因為過多或過少地結合生物大分子均可使膠體金呈不穩定狀態，它們的最佳濃度可通過如下方法獲得。
制備好的膠體金以0.1mol/L K2CO3，調pH至6.2(SPA的等電點)待與SPA結合。用一個滴定盤或一排小試管，以0.005mol/L NaCl連續稀釋50μl SPA(1mg／m1)至第十孔或第十管為止。然后，分別于每孔中加入250μ1的膠體金，5min后再加入250μ1 10％ NaCl，l min后震蕩試管，這時SPA濃度較低的孔中，膠體金由紅色變為紫色，說明SPA的量不足以包被膠體金。以膠體金未改變顏色，且SPA濃度最稀一孔膠體金與SPA的比例，計算出全部膠體金溶液所需SPA的總量，最后以10～20％ 過量加入到膠體金中，結合2—5min，再加入1％ 聚乙二醇(MW 20，000)至最終濃度為0.05％，以進一步穩定包埋后的膠體金。
[3]膠體金的濃縮純化及儲存 包被好的膠體金可用離心的方法使穩定的金顆粒沉淀于管底，而與多余的蛋白分開，使探針得以濃縮和純化。將SPA—金顆粒復合物加到幾個洗凈的離心管中，再于離心管底部加進3—6 ml 5％ 甘油、0.05％聚乙二醇、0.02％疊氮鈉的混合液墊層。純化2—5nm的金探針時，以125，000×g離心45min(4℃)；純化8～15nm直徑金探針時，以60，000×g離心45~60min(4℃)。離心后SPA—金顆粒復合物濃縮于管底部，呈暗紅色，盡量吸去無色上清后，收取暗紅色層，而緊挨管壁的致密凝集塊不應收集。濃縮純化的膠體金探針置4℃保存待用，有效期約6個月。
【臨床應用】
應用范圍 包括感染性疾病抗原、抗體檢測，如HBsAg、瘧原蟲抗原、TB—Ab、HP—Ab、HIV—Ab等；各種蛋白質抗原檢測，如AFP、CEA、肌紅蛋白、肌鈣蛋白、尿微量白蛋白、OB等；激素檢測，如HCG、LH、FSH、TSH等；藥物檢測，如嗎啡、可卡因等。適用范圍一般為定性試驗。
【金標記方法學特點及質量控制】
特異性與ELISA相似，敏感性略低于ELISA。定性檢測時單個操作(NC膜條或NC反應塊)、檢測快速(膠體金本身為紅色，不需加發色試劑，陽性反應即出現紅色斑點或條帶，整個操只需5—30分鐘)、操作簡便(蘸取或滴加標本、試劑即可)、不需特殊設備(手工)、結果明確(顯紅色，肉眼觀察)，且金標記物穩定，冷凍干燥后可在室溫長期保存。金標記方法學尤其適合個人保健、床邊檢測、基層衛生單位檢測、急診檢驗、新項目小標本量篩查等。
金標記方法學的局限性在于不易準確定量(變異系數大)、不易自動化分析、試劑成本偏高及質量控制困難。金標記法商品化試劑盒眾多，無統一管理，存在問題有：
1.命名與方法學有時不符，方法學表示不明確，包被物與檢測物表示不明確。
2.各廠家生產產品質量不一，無比較尺度。
3.試劑盒沒有標出敏感性(有時即使標出也不相符)及檢測上限(有發生前帶)，敏感性及臨界值標準不統一，造成一些疾病診斷上的假陰性、假陽性。
4.結果不穩定、重復性不滿意，試劑盒應有低濃度標準測試重復性。
5.室內質控無有效方法：試劑盒中質控點或質控線中包被的是與標記結合物能直接結合的物質，僅能作為試驗過程是否有效的參考指標(標記結合物是否失效、層析過程是否正常、被測物中有無干擾物質等)，不能反映敏感性、特異性、重復性等質量指標；室內質控應有質控物(應有低濃度)經常檢測試驗條(卡)有否呈色、呈色時間、呈色深淺，將敏感性及敏感性改變作為質控要點。
6.沒有試劑盒批檢。
【半定量與定量】
在測定一般正常體液中存在而在疾病時升高的物質時，如單以超過正常參考值上限為陽性界限往往不能滿足臨床要求。膠體金顯色深淺與被測物濃度有一定相關性，因此可對被測物進行定量檢測。
【金標半定量】
1.DIGFA：可用標準色階對比法及質控標準對照法。標準色階對比法是以與被測物濃度相對應的深淺不同的色帶板與被測反應板顯色斑點對比估計被測物濃度；質控標準對照法是以質控品同時測定對比色澤半定量。
2.DIGCA：可用質控線對比法及多條測定線法。質控線對比法質控線色澤為臨床臨界濃度顯色。多條測定線法在NC膜上置多條受體線(抗體或抗原)，顯色線條數與被測物濃度相關，或顯色線第幾條與被測物濃度達到多少濃度相關。
【金標定量】
1.DIGFA：膜上斑點免疫金標顯色終點時用光電比色，
2.DIGCA：由于反應在NC膜上呈橫流推進，測定線上反應出現的顏色逐漸加深，液流速度、反應溫度等為可變因素，很難在規定時間得到恒定結果。