wb蛋白在重復實驗時還需要煮嗎

蛋白樣品的制備是蛋白質組研究的第一步，無論后續采用怎樣的分離或鑒定手段，樣品制備都是關鍵步驟。因此，為了完全分析所有的細胞內蛋白，組織與細胞必須進行有效的破碎。本文在此介紹幾種較為常見的方法。

變性條件——SDS LB直接裂解：
用常溫或者高溫預熱過（預熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，而LB久煮會改變某些性質）的1*SDS LB（或者略高1.5*）直接加到細胞或者組織上并煮樣。

通常6孔板細胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積比類推。通常條件下，SDS LB都是過量的（因此不一定要嚴格參考SDS LB稀釋比）；如果SDS LB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高時，煮樣后會發現tip吸不上來，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。

這時候常規做法有兩種：

1.再煮5min。常規煮樣時間3-5min，樣品過濃時就煮10min；

2.如果10min煮樣后，仍然吸不起來，才適當增加SDS LB，繼續煮； 也可以對樣品進行超聲。煮樣時間若過長，蛋白會凝固，此時以失去繼續WB的意義，請丟棄（判斷標準：出現明顯的蛋白沉淀和水分層）

此方法的缺點是：SDS LB煮過的樣品如果用來做IP，需要特殊方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。

非變性裂解法：
裂解細胞請盡量冰上操作，減緩酶解作用。

裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin,10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑可用0.5mMPMSF替代；如果還要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（現加現用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mMbeta-GP。

此方法的優點：NaCl濃度略低于生理狀態，保證裂解細胞的方式較為溫和，便于隨后的IP等試驗。其他Na鹽濃度的細胞裂解液也很常見，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細胞時染色體會析出，細胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合 IP試驗，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強的復合體，要得到純化的一些復合體的組成蛋白一般采用極端的高鹽裂解細胞。

組織塊裂解：
組織塊較大用勻漿的方法最合適，現在有不少轉頭很小的勻漿器。

當組織超微量的時候，比如50mg新鮮癌組織，建議采用的方法是

1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。

2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙），進一步破碎；反復多次。