miRNA的特征、功能及識別方法等詳解（二）

miRNA的作用方式

最早被發現的兩個miRNAs——lin-4 and let-7被認為是通過不完全互補結合到目標靶mRNA 3’非編碼區端，以一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制，進而抑制蛋白質合成，阻斷mRNA的翻譯。多個果蠅miRNAs也被發現和他們的目標靶mRNAs的3’非編碼區有部分同源。由于miRNAs和其潛在的目標靶之間并非完全互補，這使得通過信息學的方法鑒定miRNA的目標靶位點變得困難。因而也無法確定miRNAs的作用方式是什么，以何種機制影響mRNA的翻譯，以何種方式調控基因表達。miRNAs的作用目標靶和活性機制一直是各地的研究人員的關注熱點。

在植物中目前有一個miRNA和3個潛在的目標靶基因完全互補（這些scarecrow 基因編碼潛在的轉錄因子），盡管目前還不清楚這些基因是否就是miRNA的目標靶，這仍是第一次發現miRNA 和其潛在的目標靶完全互補，也提示miRNA可能包含和siRNA類似的作用方式。

識別 miRNAs的方法

多個研究小組采用生物化學結合是生物信息學的方法開展對miRNAs的研究工作。由于據推測都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23個堿基大小、有5’端磷酸基和3’羥基的RNA片斷，有的實驗室采用改良的定向克隆方法來篩選具有相同特征的小分子——篩選一定大小的RNA分子，連接到3’和5’的適配子（adapters），逆轉錄并通過PCR擴增、亞克隆并測序。miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過向基因組數據庫查詢進行。這個方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產物。

有的實驗室通過一種RNA folding program ’mfold’  來判斷C. elegans 和C. briggsae 之間的高度保守區域是否含有潛在的miRNA前體，然后用Northern Blots的方法來確定這些miRNAs是否真的表達了。

盡管有數百個miRNAs通過生化或者是生物信息學的方法被鑒別出來，已經鑒別出來的miRNAs只不過是滄海一粟，由于很多已經鑒別出來的miRNAs是從單個克隆中鑒別出來的，所以可以假設還有很多miRNAs在分離和鑒定過程中被“漏掉”了，測序工作還遠遠不夠。

1) miRNA的計算機RNA組學方法

生物信息學方法是依據在不同的物種中，其成熟的miRNA 具有較大的序列同源性以及前體的莖環結構具有相當大的保守性這一特征在基因組數據庫中搜索新的miRNA 基因。該方法根據比較基因組學原理并結合生物信息軟件在已測序基因組中進行搜索比對，根據同源性的高低再進行RNA二級結構預測，將符合條件的候選miRNA與已經通過實驗鑒定的miRNA分子進行比較分析，最終確定該物種miRNA的分布及數量。近年來隨著miRNA預測方法的不斷發展，人們發現的miRNA數量呈幾何級數增長。這些預測方法從簡單的序列比對搜索發展到現在的機器學習算法，程序設計越來越智能化，復雜化。

隨著人miRNA基因轉錄出的pri-miRNA迅速加工成具有莖環結構的pre-miRNA，隨后被切割成miRNA：miRNA*雙體，并被選擇性地組合進核糖核酸沉默誘導復合體（RISC）并進行靶基因識別。在相似的物種中，miRNA是很保守的；但在相距較遠的物種間，miRNA又有一定的分歧，尤其體現在pre-miRNA上。這些miRNA功能作用機制的闡明為預測軟件的研發提供了理論依據，但仍需要不斷修補和完善。近年來，幾個基于這些規則的miRNA預測程序先后被開發(表1.1)，并被廣泛使用。