1）目的蛋白有多個修飾位點，本身可以呈現多條帶，建議查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小
2) 樣本處理過程中目的蛋白發生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作
3）雜蛋白多，建議處理目的蛋白
4）抗體特異性不強，建議使用特異性強的抗體
5）抗體孵育時間過久，建議減少抗體孵育時間
6）二抗與抗原有交叉反應，建議選擇合適的封閉物
7）二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質變性過程及強度
8）底物顯色與曝光時間過長，建議縮短顯色及曝光的時間
