樣品制備
萃取緩沖液 (10 mM NH4OOCH3/0.4 mM Na2EDTA/1% NaCl/2% TCA):
將0.77 g乙酸銨(NH4OOCH3)置于1L的容量瓶中。加入大約900 mL試劑水，溶解。使用1 N
HCl或1 N NaOH將pH值調節至4.0。加入0.15 g乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA.2H2O)、5 g氯化鈉(NaCl)和20
g三氟乙酸(TCA)。充分混合，使固體溶解，加試劑水至刻度。
初步萃取：
將2 g均勻的牛組織或10 mL牛奶置于50 mL離心管中。加入20 mL萃取緩沖液，渦旋10秒鐘，然后充分震搖1分鐘。將樣品在4000 RPM下離心5分鐘，收集上清液。按需要使用稀HCl或NaOH將上清液pH調節至6.5±0.5。
SPE凈化：
本研究使用Oasis HLB 96孔板(30 mg)。如有需要，可使用一根1 cc/30 mg的萃取柱。先后使用1.5 mL甲醇、1.5 mL水,平衡板孔或萃取柱。將流速設置為1 mL/min或更低。加入初步萃取得到的pH值調節后的上清液，對于組織樣品，加入1 mL上清液，對于乳品樣品，加入1.5 mL上清液。以1 mL水清洗。用0.5 mL 10:5:85的甲酸/異丙醇/水洗脫。加入1.5μL HFBA，使用UPLC/MS/MS進行分析。
結果與討論
圖2是由加標牛奶樣品得到的重現的UPLC/MS/MS圖譜。相同的條件也可用于牛 肉樣品的分析。
表2(乳品)和表3(肌肉組織)顯示加標實驗得到的結果在。新霉素(B和C)和慶大霉素(C2a和C2)
以同份異構體形式出現并得到部分分離。對這些樣品的峰面積進行加和，以便進行定量分析。
回收率的測定方法是將樣品制備前加到樣品基質中的標準品的MRM峰面積與在所有樣品制備步驟完成后加到樣品基質中的標準品的峰面積進行對比。
肉類的基質效應低于30%，乳品的基質效應低于12%。與其他被使用的諸多抗生素獸藥不同，氨基糖苷類抗生素不能使用有機溶劑從動物組織和相關樣品中萃取出來。但是，這些化合物可以使用水性緩沖液有效地從組織中萃取出來。該萃取緩沖液包括促進蛋白質沉淀的試劑(TCA)。
Oasis HLB固相萃取方法使用有機溶劑含量低的洗脫液，與其他甲醇型洗脫液相比(使用甲酸/甲醇洗脫的基質效應大于50%)可使凈化效果得以提高。很明顯，使用水性洗脫液洗脫氨基糖苷類后，吸附劑上能保留大量的基質干擾成分。
選用離子對反相色譜模式UPLC分析。通過使用20 mM七氟丁酸作為離子對試劑實現峰形和靈敏度最佳平衡。也考慮了使用親水性相互作用色譜的UPLC分析，但是，峰形并不如所選方法得到的峰形尖銳。另外，親水性相互作用色譜模式的缺點是標準品和樣品的稀釋劑應當為乙腈。本應用紀要中提供的優化的固相萃取法提供水性樣品進樣，更適于反相色譜分析。
結論
■使用針對離子對反相色譜的ACQUITY UPLC HSS PFP分析色譜柱可獲得出色的UPLC性能。
■七氟丁酸(HFBA)是一種用于UPLC分析的有效離子對試劑。
■提出了從牛肉和牛奶中萃取氨基糖苷類抗生素的簡便程序；一個操作人員每天即可輕松分析20個樣品。
■提出了使用Oasis HLB 96孔板的優化的固相萃取方法。牛奶樣品分析的檢測限為10 ppb，牛肉樣品分析檢測限是50 ppb；對于在該水平的所有分析物，分析信噪比大于100:1。
參考文獻
1. Screening and Confirmation for Aminoglycosides by UHPLC-MS-MS
(United States Department of Gariculture Food Safety and Inspection Service,
Office of Public Health Science).
2. Plozza T, Trenerry VC, Zeglinski P, Nguyen H, Johnstone P. The Confirmation and Quantification of Selected Aminoglycoside Residues in Animal Tissue
and Bovine Milk by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry.
International Food and Research Journal. 2011; 18(3): 1077-1084.