Southernblot對動物細胞基因組DNA中小衛星多態性的檢測

實驗概要

本實驗介紹了動物細胞基因組DNA中小衛星多態性Southern blot檢測的原理和操作步驟。掌握核酸雜交檢測技術（Southern blotting技術）、核酸探針的標記技術、小衛星DNA多態性檢測分析技術（DNA 指紋圖譜技術）和化學發光檢測技術。

實驗原理

Southern印跡雜交技術包括兩個主要過程：一是將待檢測的核酸分子通過一定的方法轉移（電轉印、虹吸轉印、真空轉印）并結合到一定的固相支持物（硝酸纖維素、尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸與特定標記[放射性同位素、地高辛（DIG）、生物素（biotin）等]的核酸探針在一定溫度和離子強度下復性（退火），即分子雜交。該技術是1975年英國愛丁堡大學Southern發明的，固命名Southern印跡雜交技術。利用Southern印跡雜交技術可進行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組中某一基因的定性和定量分析、基因突變分析及限制性長度片段多態性分析（RFLP）。
固相膜核酸分子雜交的主要步驟及原理如下：
1.  DNA的變性： DNA變性解鏈是雜交成功的關鍵。Southern印跡雜交時DNA在凝膠中變性，變性方法是將凝膠浸在數倍體積的1.5M  NaCl和0.5M NaOH中1h然后用數倍體積的1M Tris-HCl (pH8.0)和1.5M  NaCl溶液中和1h。DNA受酸、堿、熱等處理均能發生變性，但強酸會使核酸降解。一般認為堿變性較好，可避免DNA降解。熱變性在要低DNA濃度（100μg/ml）和低鹽濃度（0.1M  SSC 含15mM NaCl - 1.5mM檸檬酸三鈉，pH7.0）下進行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml，加10M  NaOH使最終濃度為0.1M（pH約12.8），室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10M HCl或5M NaH₂PO₄調pH到7~8（亦可用堿變性后，調至中性，再加熱100℃10min），DNA變懷可用OD260增加（約30~40%）來檢測，變性DNA沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰浴保存。
2.   變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定：硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45μm）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min~2h，涼干。DNA樣品轉移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后在80℃真空干燥2h。DNA樣品也可以轉移或加至尼龍膜（nylon  membrane）上，再用高溫烘烤或紫外交聯的處理固定在尼龍膜上。
3.  預雜交：濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋或雜交管中，按每平方厘米濾膜加0.2ml預熱至60℃的預雜交液（6×SSC，0.5%  SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調濃度至10mg/ml，用前放100℃水浴中煮沸變性10min，冰水驟冷。若在塑料袋中雜交，盡可能將袋中氣泡趕盡，可封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68℃水浴保溫3~12h。當預雜交液溫度升至68℃時，在濾膜表面常會形成小氣泡。輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點對于保證濾膜表面充分浸潤預雜交液很重要。若在雜交管中雜交，只需將雜交管置入核酸雜交爐（箱）內的旋轉支架，調解到到一定轉速和雜交溫度，完成雜交。
4. 雜交：從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開一角，盡可能擠凈預雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤（50μl/cm²）。溶液的組成是6×SSC，0.01M   EDTA，變性的標記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS，100μg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴密封口，雜交反應在68℃水浴中進行，所需時間視探針和檢測靶DNA的性質及探針的比活性等情況而定，一般4~20h。若在雜交管中雜交，只需傾去預雜交液，雜交管內加入含雜交探針的雜交液，繼續在核酸雜交爐完成雜交。
5.   洗膜：取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤中，室溫下漂洗5min。再將濾膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中，室溫下洗滌15min（輕輕搖動）。然后將濾膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃輕輕搖動保溫2h，更換緩沖液后繼續保溫30min。洗膜的溫度一般應控制在低于Tm值12℃以上。若在雜交管中洗膜，只需傾去雜交液，雜交管內加入相同洗膜液，繼續在核酸雜交爐旋轉洗膜。
6.   結果顯示：固相膜的放射性雜交結果顯示有兩種方式，一是放射性自顯影法，另一種是液閃計數法。前一種方法比較簡單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中曝光數小時至數天，再顯影、定影即可。對于雜交信號較弱的固相膜，用一塊增感屏可顯著增強曝光強度。固相膜的非放射性雜交檢測一般采用化學發光技術。常用的化學發光技術系統有兩種，一種是堿性磷酸酶（AP）系統，包括：
   1) Probe DNA-DIG → Anti-DIG-Ab-AP → Chemiluminescent Substrat (CSPD)；
   2) Probe DNA-biotin → Streptavidin-HRP → ECL。

圖1 Southern 凝膠轉移雜交技術

圖2 Southern blot 技術逐步圖解

主要試劑

1. 限制性內切酶Hae III：Fermentas Life Sciences
2. 限制性內切酶Hinf I：Fermentas Life Sciences
3. Biotin標記的33.6 和33.15 兩種人源小衛星探針。
33.6小衛星探針：
5′- Biotin-AGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGG-3′
33.15小衛星探針：
5′- Biotin-AGAGGTGGGCAGGTGGAGAGGTGGGCAGGTGGAGAGGTGGGCAGGTGG-3′
4. 5×TBE緩沖液：0.45M Tris-硼酸(borate)，0.01 M EDTA。
5. 6×載樣緩沖液：0.25%溴芬藍，0.25%二甲苯青FF，30%甘油
6. 脫嘌呤液：0.25M HCl。
7. 變性液：0.5M NaOH，1.5M NaCl。
8. 尼龍膜（N -nylon membrane）：帶正電荷的尼龍膜。Roche
9. 20×SSC：3M NaCl，0.3M 檸檬酸鈉（sodium citrate），NaOH 調pH為7.0，高壓滅菌，室溫保存。
10. 10% SDS：900ml水溶解100g電泳級SDS。加熱到68°C并用磁力攪拌器攪拌助溶。若需要，加幾滴濃HCl調解pH為7.2，用水定容到1000ml。室溫保存，無須滅菌。
11. Denhardt's溶液：0.02%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP），0.02% 聚糖體400（Ficoll 400），0.02% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)。
Denhardt’s溶液可配制成50×儲存液，過濾后保存在-20°C。使用時將儲存液10倍稀釋在雜交緩沖液中。Denhardt's溶液用水配制。50×儲存液：1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP），  1% 聚糖體400（Ficoll 400），1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)。
12. 預雜交及雜交液：6×SSC，0.5% SDS，5×Denhardt's溶液，100 μg/ml 變性剪切的鮭魚精DNA（denatured，sheared salmon sperm DNA）或酵母tRNA。
13. 探針剝離液：0.2M NaOH，0.1% SDS。塑料瓶室溫保存。
14. 馬萊酸（Maleic Acid）緩沖液：0.1M馬萊酸，0.15M NaCl；固體NaOH 調pH至7.5，高壓滅菌，室溫保存。
15. 室溫洗膜液：2×SSC，0.1% SDS。
16. 60°C嚴謹洗膜液：0.5×SSC，0.1%SDS。
17. 洗膜緩沖液：馬萊酸緩沖液加0.3%（v/v）Tween-20。
18. 封閉緩沖液：含5% BSA的馬萊酸緩沖液，現配現用。
19. 辣根過氧化物酶（HPR）標記的鏈親和素（streptavidin）（HRP-Streptavidin）。
20. HRP-Streptavidin反應液：HRP-Streptavidin 1:5000稀釋在洗膜緩沖液中，現配現用。
21. HPR化學發光底物ECL（SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate）：Pierce Biotechnology（Rockford，IL）公司。
22. 顯影液：皇冠牌X光膠片顯影粉（無錫市服務用品廠）配制。
23. 定影液：皇冠牌X光膠片酸性堅膜定影粉（無錫市服務用品廠）配制。

主要設備

1. 雜交爐：Model 2000 Micro Hybridization Incubator (Robbins Scientific)。
2. 電轉印儀：Multiphor II Electrophoresis System NovaBlot Kit (Amersham Biosciences)；
3. X-射線攝影暗匣：規格203mm×254mm（汕頭市粵華醫療器械廠）。
4. X-光片：上海申貝辦公機械有限公司感光材料廠。

實驗材料

采集人靜脈血，EDTA 抗凝，提取DNA。

實驗步驟

1. 用Hae Ⅲ或Hinf I徹底消化10μg 基因組DNA。

2. 加入9μl的6×載樣緩沖液，混勻。
3. 上樣于0.8 %的瓊脂糖凝膠中(電泳緩沖液為0.5×TBE，膠長500px) ，在20V （約1V/cm）下電泳至2 kb 以下片段完全出膠時停止(二甲苯青FF帶離凝膠陽極端邊沿100px)。

4. 將凝膠在脫嘌呤液中浸泡20 min；室溫輕輕晃動，直到溴酚藍從藍變黃。
5. 蒸餾水洗滌凝膠1次。
6. 將凝膠在變性液中浸泡30min
7. 將凝膠在0.5×變性液中浸泡20min。
8. 將凝膠用進行Southern 轉印（Southern blot）：
   1) 虹吸轉印（毛細轉印）：
      a. 凝膠小心平推到一塊玻璃板上（加樣孔超上）；
      b. 裁剪6張與凝膠同樣尺寸的濾紙，用0.5×變性液浸濕后平鋪在凝膠上，用玻璃棒趕去氣泡；濾紙上覆蓋一塊玻璃板；
      c. 捏住兩塊玻璃板，翻轉后放到實驗臺面上，再小心揭掉上面的玻璃板。
      d. 裁剪一張與膠同樣大小的帶正電荷的尼龍膜，用0.5×變性液浸濕后小心平鋪在膠表面，用玻璃棒除去凝膠和膜之間的氣泡；
      e. 裁剪6張同樣尺寸的濾紙，用0.5×變性液浸濕后平鋪在尼龍膜上，用玻璃棒趕去氣泡；濾紙上平整覆蓋5~250px厚的吸水紙。
      f. 吸水紙頂上加一玻璃板。
      g. 將“吸水紙-濾紙-尼龍膜-凝膠-濾紙”整個轉印裝置用保鮮膜密封。
      h. 在玻璃板上放一重物（400g）。室溫下轉印過夜。
   2) 電轉印：
      a. 將膠小心平放在干凈投影膠片上；
      b. 裁剪一張與膠同樣大小的帶正電荷的尼龍膜，用0.5×TBE浸濕后小心平鋪在膠表面，用玻璃棒除去凝膠和膜之間的氣泡；
      c. 裁剪6張同樣尺寸的濾紙，用0.5×TBE浸濕后平鋪在尼龍膜上，用玻璃棒趕去氣泡；
      d. 在膠的另一面同樣鋪上6層0.5×TBE預先浸濕的濾紙，排除氣泡；
      e. 將“濾紙-尼龍膜-凝膠-濾紙”轉印裝置移入電轉印儀中，使尼龍膜面向陽極，凝膠面向陰極（即“陽極←濾紙←尼龍膜←凝膠←濾紙←陰極”），接通電源，室溫下，100 mA轉印60 min。

圖3 毛細管虹吸法Southern轉移裝置

圖4 電轉引裝置

9. 轉印完成后，取出尼龍膜，在2×SSC 中浸泡20 min。
10. 尼龍膜DNA面朝上置于濾紙上，再覆蓋一張濾紙，60oC烤膜30 min。
11. 將尼龍膜DNA面朝上裝入雜交管中。
12. 尼龍膜按0.1~0.2 ml/cm² 預雜交液體積60℃預雜交4 h。
13. 33.6 或33.15小衛星探針98℃變性10min，立即放入冰浴中5min。
14. 將探針按預實驗確定的信噪比最價濃度加入60℃雜交液中，雜交液按0.05 ml/cm2體積60℃雜交過夜。
15. 尼龍膜用室溫2×SSC、0.1% (w/v) SDS 漂洗2×10min
16. 尼龍膜用60 0.5℃×SSC、0.1% (w/v) SDS漂洗2×20min。
17. 對尼龍膜進行化學發光法檢測：

注意事項

1. 膜雜交中³²P標記探針與非放射性標記探針的用量分別為5～10ng/ml和25～1000ng/ml。

2. 人DNA用Hinf I 和/或 Sau3A消化，用含有人小衛星的32P-標記的單鏈DNA探針進行Southern blot雜交，其中人小衛星是由一個共同序列的密切相關的變異體串聯重復構成。

附    件   (共7個附件,占564KB)

未標題-1.jpg

61KB  查看

未標題-4.jpg

55KB  查看

未標題-3.jpg

108KB  查看

未標題-2.jpg

115KB  查看

1.jpg

43KB  查看

未標題-6.jpg

96KB  查看

未標題-5.jpg

86KB  查看