PEA鄰位延伸分析技術的進化史洞見蛋白組質組學未來

從中心法則洞見蛋白組質組學發展未來

上世紀60年代末，分子生物學中心法則（Genetic Central Dogma）首次從分子水平揭示生命遺傳信息的傳遞奧秘。這一黃金中心法則“DNA轉錄生成RNA，RNA翻譯產生蛋白質，蛋白質反過來協助前兩項流程，并協助DNA完成自我復制”在近60年生命科學發展的過程中不斷得以驗證及闡述。

圖1: 分子生物學中心法則

人類基因組數據顯示，人類大約有2萬個基因，是生命奧秘的一級密碼。近幾年， NGS基因測序和qPCR技術已長足進步，可高通量、多通道地對DNA進行快速鑒定和準確定量，靈敏度及特異性可達特定基因單拷貝。隨著20世紀初人類基因組圖譜完成，基因組學、轉錄組學、蛋白組學及多組學技術平臺也日新月異，生命科學和現代醫學伴隨著轉化醫學快速發展已步入精準醫療/個性化醫療時代[1]。

根據中心法則，從DNA到RNA再到蛋白質，這一過經歷了轉錄調控、翻譯修飾和蛋白互作等復雜的生物學過程，信息量也將上升1-2個數量級。蛋白質作處于中心法則下游，且是生命活動的最終執行者，其在生命及疾病發生/發展過程中的意義不言而喻，因此，如同人類基因圖譜的重大意義，后基因組時代對人類蛋白質組的系統性研究勢在必行[2]。

但是，目前蛋白質組學研究遠落后于中心法則上游基因組學，一方面是源于蛋白質本身的復雜性，另一方面是受限于現有的蛋白質學技術平臺。目前常用的蛋白組學方法，包括雙向凝膠電泳、蛋白/抗體芯片和生物質譜等。上述方法都受限于檢測速度、通量、多重檢測能力、靈敏度等關鍵因素，使其不能對復雜而龐大人類蛋白組獲取充分而有效的信息。傳統的蛋白質組學技術中，生物質譜是最常用的方法，可對未知和已知蛋白進行鑒定及定量。但對于低豐度的蛋白，質譜法仍有局限性；此外，蛋白質譜檢測需要較長的時間，數據分析也對專業性有很大依賴。以上，都成為了蛋白質組學發展的限速因素。

PEA鄰位延伸分析技術的進化史

    是否有一種蛋白組學技術，既有基因組學的高通量，又保留了蛋白/抗體識別的特異性，同時克服低豐度檢測的局限性？蛋白組學技術新秀—鄰位延伸分析技術（Proximity Extension Assay, PEA）給這個問題帶來了一個滿分答案，也是人類蛋白組學研究這場技術革命的顛覆者。

PEA技術是一種高通量、高特異性、高靈敏度、高動態范圍的靶向蛋白質組定量檢測平臺，結合了抗體免疫分析的高特異性和基因組學的高靈敏度/高通量。PEA技術中包含一對可識別目標蛋白的特異性抗體，抗體上偶聯有特定的DNA單鏈，當這對抗體結合目標蛋白后，處于鄰位的兩條DNA單鏈可互補結合并經鏈接酶延伸形成雙鏈DNA模板，巧妙地將蛋白質定量轉換為DNA定量，最后利用微流控qPCR或NGS測序進行定量檢測。

PEA原理視頻

說起PEA技術，其實他已有近20年的成長進化史，是瑞典Uppsala大學分子醫學Ulf Landegren教授團隊在2002年發明的一項新技術，最早的名字為鄰位連接分析技術（Proximity Ligation Assay, PLA）[4]。2004年，Ulf Landegren教授團隊，通過不斷對PLA技術進行優化，用一對特異性抗體替代最早的DNA-Aptamer核酸適配體，該均相免疫學檢測可在1微升樣品中檢測出fmol 級目標蛋白，比傳統ELISA方法靈敏度提高3個數量級，且可進行高通量、超多重檢測[5]。

圖5: Ulf Landegren教授 [3]

2008年，多家實驗室和醫院聯合，在醫學雜志《Clinical Chemistry》發表文章，首次將PLA技術用于血漿樣品多重生物標志物檢測；且與固相方法相比，PLA方法具有更好的一致性、靈敏度和可擴展性[6]。2011年，Olink Bioscience（Olink Proteomics 前身）研發團隊對PLA技術進一步優化，采用在復雜樣品中酶活性更高且更穩定的DNA聚合酶代替原來的DNA連接酶，PLA鄰位連接分析技術升級為PEA 鄰位延伸分析技術，可進一步提高檢出率和靈敏度[7]。

2014年Olink Bioscience研發團隊聯合丹麥Copenhagen大學健康和醫學研究院，開發出基于qPCR檢測的96-plex PEA平臺，可一次性實現96重蛋白標志物定量檢測[8]。2016年Olink Proteomics公司正式成立，致力于為人類健康提供創新且有效的蛋白生物標志物發現及檢測方法。在2017和2020年，PEA Olink^TM Focus 訂制化平臺和OlinkTM Target 48重檢測平臺分別發布，以更適應Mid-plex生物標志物檢測市場需求。2021年下半年，Olink推出專為Target 96/48/Focus全新設計的Signature Q100檢測儀器。

在NGS測序技術基礎上，Olink公司于2020年推出 Explore 384/1536 平臺，可同時檢測384或1536中蛋白生物標志物。2021年5月鐘雯博士（第一作者）在《Nature Communication》雜志上，運用Explore 1536平臺研究二型糖尿病患者在二甲雙胍治療前/后血漿蛋白組改變，發現4個蛋白標志物在治療前/后顯著差異表達[9]。2021年下半年，Olink又在全球范圍內發布Explore 3072平臺，可從不到8微升樣品中檢測超過3000種蛋白標志物，并覆蓋100%主要生物學通路；這意味著，血漿蛋白組檢測實現了生物學意義上的「無偏」，具有劃時代的意義。

參考文獻:

1. Integrating Genes Affecting Coronary Artery Disease in Functional Networks by Multi-OMICs Approach. Front. Cardiovasc. Med., 17 July 2018.

2. Proteomics Complexity: https://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-2-molecular-biology/24-proteins/proteome.html

3. Ulf Landegren Bio: https://www.vibconferences.be/speaker/ulf-landegren

4. Fredriksson S et.al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. (2002) Nature biotechnology 20:473-477.

5. Gullberg M et.al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. (2004) PNAS. 101:8420-8424.

6. Fredriksson S. et.al. Multiplexed proximity ligation assays to profile putative plasma biomarkers relevant to pancreatic and ovarian cancer. (2008) Clinical chemistry 54:582-589.

7. Lundberg M. et.al. Homogeneous antibody-based proximity extension assays provide sensitive and specific detection of low-abundant proteins in human blood. (2011) Nucleic acids research 39:e102

8. Assarsson E. et.al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. (2014) PloS one 9:e95192

9. Zhong W. et.al. Next generation plasma proteome profiling to monitor health and disease.（2021）Nat Commun. 12(1):2493.