PCRArray簡單實用的檢測基因表達的高通量方法

簡介：什么是PCR芯片？

實時定量PCR是檢測基因表達最靈敏，最可靠的方法。通過在試驗過程中，實時監測熒光染料的信號變化，反映樣品中的基因拷貝數。實時定量PCR線性范圍廣（能達到5個數量級），因此可以檢測同一樣品中表達量極低的基因和表達量很高的基因。但是，由于實時定量PCR需要制備標準曲線和同時分析內參基因，因此，每次實驗只能檢測少數幾個基因的表達水平，若要檢測大量基因，則工作量巨大，耗時長久。

通過簡單的，經過優化的實時定量PCR體系，如SuperArray的RT2ProfilerTM PCR芯片，研究者可以同時研究大量基因，既可以進行某些特別感興趣的信號通路的研究，也可以作為驗證芯片結果的方法。

為了獲得理想的實驗結果，PCR芯片面臨以下挑戰：高特異性，高靈敏度和可重復性。高靈敏度或低檢出限，在樣品的總RNA量少，基因表達量低的情況下，也能檢測出目的基因。高特異性，擴增產物嚴格保證基因特異性，避免非特異性產物，如引物二聚體的產生。可重復性，通過標準化的反應體系和實驗方法，使得多人多次重復實驗均能獲得可靠的基因定量結果。

PCR芯片實驗操作步驟

采用PCR芯片進行實驗只需2小時。PCR芯片實驗過程如圖1所示：首先將RNA樣品反轉錄為cDNA第一鏈，作為PCR模板；接著，將模板加入到反應體系（RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR Master Mix）中。在已經固定好基因特異性引物的96孔板各孔中，加入等量的PCR反應體系，進行PCR反應。采用儀器配套的軟件計算PCR芯片中的每個基因的循環閾值（Ct）。最后，采用△△Ct方法比較對應的兩個樣本中同一基因的表達量變化。通過分析看家基因Ct值的一致性，可確定合適的標準化方法。芯片所設置的對照，可以檢測PCR體系中是否存在DNA污染，或者是否有影響反轉錄或PCR實驗步驟的因素存在。
 

圖一 PCR芯片實驗流程

PCR芯片的設計和所包含的基因

96孔模式的每種RT2Profiler PCR芯片，含有基因特異性引物，可用于研究84個與某種信號通路或者疾病相關的基因。此外，芯片中還有設置了3個檢測實驗質量的對照。圖2為PCR芯片模式圖。由于每種芯片都是根據特別的信號通路或者特定的應用范圍設計的，研究者可以用它來研究自己感興趣的一組基因，一個生物學通路或者某種疾病狀態。PCR芯片所研究的基因范圍相對集中，大大節省了在數據分析方面所花費的時間，相對更簡潔針對性更強的信息也有利于接下來的更深入更準確的研究。因此，研究者使用PCR芯片，可以在更短的時間內得到更豐富的信息。此外，Superarray將相關基因設計在同一張PCR芯片內，為實驗準備階段也提供了方便。