問題
可能原因 | 解決方法 | |
無產物或產量低 | 模板濃度偏低或偏高 | 電泳檢測模板濃度，調整模板用量 |
模板降解 | 重新制備；基因組DNA、cDNA應小量分裝后低溫保存 | |
模板中含有抑制反應的雜質 | 純化模板 | |
引物濃度不足 | 調整引物濃度，特別是針對長片段PCR | |
引物存在二級結構 | 重新設計引物，避免二級結構；優化退火溫度 | |
引物降解 | 引物應高濃度小量分裝，-20℃保存，避免反復凍融 | |
Mg2+濃度偏低 | 適當提高Mg2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索最佳Mg2+濃度 | |
dNTP降解 | -20℃保存，小量分裝，避免反復凍融 | |
酶純度低，擴增效率差 | 選用高質量DNA聚合酶 | |
酶量不足 | 適當增加酶量 | |
用酶不當 | 針對模板、目標片段的特選擇適當的酶(詳見PCR產品選擇指南) | |
緩沖液失效 | 更換緩沖液或使用預混PCR反應體系 | |
模板變性不充分 | 適當延長變性時間；對高GC或復雜結構模板，提高起始變性溫度至98℃ | |
退火溫度偏高 | 降低退火溫度，應比引物Tm低至少5℃ | |
延伸時間不足 | 增加延伸時間，特別是針對長片段PCR | |
循環數目不夠 | 增加循環數 | |
PCR管污染 | 質量可靠的PCR管通常不需滅菌，否則應先高溫高壓滅菌處理；用過的PCR管不可清洗后重復使用 | |
PCR儀故障 | 檢查程序和模塊溫度 | |
其他 | 使用PCR增強劑 | |
非特異產物過多 | 體系污染 | 設計對照實驗尋找污染源，操作時應注意避免交叉污染 |
引物濃度過高 | 適當減少引物濃度 | |
引物序列特異性差 | 重新設計引物 | |
Mg2+濃度過高 | 降低Mg2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索最佳Mg2+濃度 | |
dNTP濃度過高 | 降低dNTP濃度 | |
酶量過多 | 減少酶量，以0.5 U間隔遞減 | |
退火溫度過低 | 提高退火溫度 | |
延伸時間過短 | 增加延伸時間，以1 min間隔遞增 | |
循環次數過多 | 減少循環次數 | |
模板結構過于復雜或目標片段過長 | 特選擇適當的酶(詳見PCR產品選擇指南)；使用PCR增強劑 | |
其他 | HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR | |
引物二聚體 | 引物3’末端存在互補序列 | 重新設計引物 |
引物濃度過高 | 降低引物濃度 | |
模板濃度過低 | 提高模板濃度 | |
退火溫度不合適 | 優化退火溫度 | |
循環次數過多 | 減少循環次數 | |
其他 | HotStart PCR | |
拖尾嚴重 | 引物濃度過高 | 調整引物濃度 |
引物序列特異性差或模板上存在同源序列 | 重新設計引物 | |
模板降解 | 重新制備模板 | |
模板濃度過高 | 降低模板濃度 | |
dNTP濃度過高 | 減少dNTP用量 | |
Mg2+濃度過高 | 降低Mg2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索最佳Mg2+濃度 | |
酶量過多或質量差 | 減少酶量，以0.5 U間隔遞減；更換質量可靠的酶 | |
變性溫度過低 | 提高變性溫度，以0.5℃遞增 | |
退火溫度過低 | 提高退火溫度 | |
延伸時間過長 | 縮短延伸時間 | |
循環次數過多 | 減少循環次數，以2個循環間隔遞減 | |
體系污染 | 設計對照實驗，消除污染源 | |
其他 | HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR | |
假陽性 | 目標片段與非特異擴增片段間存在同源性 | 設計陰性對照，確認為引物問題后重新設計引物 |
體系污染 | 設計陰性對照判斷是否有污染，去除污染源 |