引物長度要滿足特異性需要,一般可在18~25個堿基之間；擴增長片段時最好在24~30個堿基之間；
· 當引入克隆位點時,引物末端應額外增加3個以上堿基；
· (G+C)%含量應盡量控制在40~60%,兩條引物的(G+C)%含量應盡量接近；
· 引物中GC堿基分布均勻；
· 盡量避免相同堿基連續出現三次以上,3’端應避免使用A或T；
· 避免引物內部自身配對形成二級結構；
· 正反向引物之間應避免配對堿基,尤其是3’端的三個堿基,否則易生成引物二聚體(Primer dimer)；
· 兩條引物的解鏈溫度(Tm)值應在42~65℃之間,而且兩條引物間最好相差不超過5℃；
· 引物Tm值的計算方法:
20 nt以下:Tm = 2℃ x (A + T) + 4℃ x (G + C)
20 nt以上:Tm = 81.5 + 0.41 x (GC%) -600/nt (nt:引物的堿基數)
· 引物用量:
· 0.1~1.0 μM,通常可以0.2 μM起始,根據體系不同調整用量；
· 使用簡并引物、隨機引物時,需增加引物總量以彌補產量損失；但隨著引物量加大,特異性將降低；
· 模板較大較多,或結構較復雜(如人基因組DNA)時,需減少引物用量以提高特異性；
· 模板較小較少(如質粒模板)時,增加引物用量可提高產量。