NatureMethods：單細胞RNAseq方法的比較

　　隨著大家對單細胞轉錄組分析的興趣日益增加，開展單細胞RNA-seq的方法也在不斷涌現。近日，斯坦福大學的研究人員比較了市場上各種單細胞RNA擴增方法，以系統評估單細胞RNA-seq方法的靈敏度和準確性。他們的研究結果發表在《Nature Methods》在線版上。

　　目前，整個轉錄組的高通量測序(RNA-seq)已廣泛用于各種組織的基因表達分析。然而，人們開展單細胞轉錄組分析的愿望也越來越強烈，這是因為有些細胞量少珍貴，不足以開展傳統的RNA-seq，也有人希望對異質群體中的細胞亞群開展分析。過去的基因表達“平均值”已不再能滿足人們的需求。

　　近年來，開展單細胞RNA-seq的各種方法時有報道，但關于這些方法的通量和性能還存在一些問題。比如說，性能主要是通過靈敏度和精確性來評估的。然而，為了評估測定方法的有效性，還應當評估準確性，即測量值與真實值之間有多接近。

　　為此，斯坦福大學生物工程系的Stephen R Quake領導的研究小組對102個人類單細胞轉錄組進行了定量的RNA-seq分析。他們采用了三種單細胞RNA擴增方法，分別為SMARTer Ultra Low RNA Kit(Clontech)、TransPlex Kit(Sigma-Aldrich)以及利用C1微流體系統(Fluidigm)進行SMARTer cDNA合成。同時，他們也利用大量總RNA開展傳統的RNA-seq，并通過多重qPCR對同一細胞類型中的40個基因進行獨立定量，來評估單細胞方法的準確性。

　　由于很難獲得絕對表達水平，研究人員計算了每種細胞的相對表達水平，即相對所有轉錄本中位數表達的基因表達。所產生的無量綱數應獨立于測定方法，可直接比較，以確定方法的準確性。他們發現，對于單細胞方法，qPCR和RNA-seq的表達值相關性良好(r > 0.84)，證實了單細胞RNA-seq方法能夠以定量的方式檢測基因表達，與目前的金標準qPCR方法一致。

　　有趣的是，各種方法之間的相關系數和線性回歸的斜率不同。相關系數表示每種方法能夠在多大程度上再現 qPCR所測定的表達，而斜率表示一些失真。他們發現，以納升體積開展樣品制備(C1系統)產生了幾乎為1的回歸斜率，表明絕對準確性最高。一種可能的解釋是，減小反應室的體積可增大反應物的有效濃度，減少模板與非特異分子之間的競爭，從而減少擴增偏向。

　　此外，研究人員還直接比較了微升和納升級的樣品制備，發現對于qPCR和RNA-seq，以納升體積制備的樣品都產生了更少的假陽性。作者認為，與管式的樣品制備相比，C1平臺表現出一些優勢，包括假陽性低和偏向小。

　　作者總結道，他們的結果表明，單細胞RNA-seq可產生與qPCR相當的結果，特別是在以納升反應體積制備樣品時(如微流體裝置C1)。通常在樣品制備過程中引入的偏向減小，而相關性也進一步提高。他們希望，低偏向、高通量的單細胞RNA-seq將讓原代組織的研究變得常規。