Nature子刊：巧解基因編輯脫靶問題

　　科學家們發現，只需要對一種強力基因編輯工具作一個簡單的改動，就能大大提高它的特異性。

　　在合成蛋白CRISPR-Cas RNA引導性核酸酶(RNA-guided nucleases，RGNs)中，引導性RNA(gRNA)是一個重要的組分。麻省總醫院(MGH)的研究人員發現，對gRNA的長度稍加調整，就能大幅減少預定目標之外的DNA突變。文章于一月二十六日發表在Nature Biotechnology雜志上。該研究團隊去年剛剛發表文章，指出了CRISPR-Cas技術可能存在的脫靶問題。(Nature子刊：強大基因編輯工具可引起脫靶突變)

　　“我們只是簡單截短了gRNA靶標區域的長度，結果發現在之前檢測到的脫靶位點，脫靶突變都大幅減少，”文章的資深作者，麻省總醫院的病理系研究副主任J. Keith Joung博士說。“與全長gRNA相比，一些位點的突變頻率甚至減少了5,000倍以上。重要的是在靶向它們的預定目標DNA時，這些縮短了的gRNA(稱為tru-gRNA)與全長gRNA同樣有效。”

　　CRISPR-Cas RGN結合了被稱為Cas9的DNA剪切酶，和一段與目標DNA片段匹配的短RNA。人們將其用于切割特定的DNA片段，以便進行基因改造。去年Joung的研究團隊報告，CRISPR-Cas RGN會在人類細胞中發生脫靶，如果DNA片段與目標片段的差異在五個核苷酸以下，就會出現脫靶突變。這一問題大大限制了該技術在臨床上的應用。為此研究人員繼續進行研究，結果意外地發現縮短gRNA能夠減少脫靶突變。

　　“我們去年的實驗顯示，gRNA互補區域一端發生幾個核苷酸的錯配，不會影響靶標活性，” Joung解釋道。“于是我們猜想，去除這些核苷酸也許可以使整個系統對剩余序列的錯配更加敏感。”

　　CRISPR-Cas RGN的基礎是一種細菌用于抵御其他病原體的天然系統，最常見的用法是在gRNA中包含二十個核苷酸的靶向區域。為了測試他們的理論，MGH的研究團隊通過逐步縮短gRNA，構建了一系列RGN。他們發現，17/18個核苷酸的靶向區域，能夠比全長gRNA更有效地靶向預定序列。但如果gRNA的靶向區域只有15/16個核苷酸，活性就會很弱甚至完全沒有活性。進一步研究顯示，17個核苷酸的靶向區域能夠有效在人類細胞中引入突變，其脫靶效應非常小，就算在只有一兩個核苷酸錯配的位點，也幾乎檢測不到脫靶。

　　“盡管我們還沒有完全理解tru-gRNA減少脫靶效應的機制，但我們猜測原始系統擁有過多的能量，使它可以剪切不完全匹配的位點，”哈佛醫學院副教授Joung說。“通過縮短gRNA，我們將能量減少到只夠進行精確剪切的水平，令核酸酶無暇剪切脫靶位點。這其中的具體機制還有待進一步實驗的驗證。”