MSCs分化為礦化的成骨細胞(細胞培養1)

MSCs分化為礦化的成骨細胞 試劑和材料：

1. 完全培養基（CCM）：α-MEM：α-低限量基礎培養基，含谷氨酰胺，無核苷酸或脫氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、經F雜交瘤純化，非熱滅活、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。過濾除菌。儲存于4℃，不超過2周；

2.DM（骨分化培養基）：CCM包含5mmol/L eta;-甘油磷酸，50μg/ml抗壞血酸-2-磷酸和1nmol/L地塞米松。過濾除菌；

3.A；

4.胰蛋白酶/EDTA；

5.聚丙烯離心管，15ml和50ml；

6.組織培養皿，6孔，孔面積為9.6cm2；

7.ARS：蒸餾水配制1%ARS，用0.5N氫氧化氨調節pH值到4.1，過濾除菌；

8.福爾馬林緩沖液，10%；

9.改良的Neubauer血細胞計數器；

實驗方法：

1. 從單層細胞中收集MSCs；

2.向6孔培養板的每個孔中加入2ml CCM，共有1&time104個細胞（適用于人或大鼠）。最終密度約1&time103個細胞/cm2；

3.將上排3個孔標記為“成骨”，下排3個孔標記為“陰性”；

4.在37℃，5%CO2環境下孵育，每隔兩天更換一次培養基，直到細胞達到7.%—80%匯合；

5.達到所需的細胞密度時，從孔中吸出完全樣機，向6孔培養板上排的孔中加入2ml BDM，向下排的孔中加入2ml CCM；

6.在37℃，5%CO2環境下孵育，每隔兩天更換一次培養基。ARS檢測時，于21天對細胞進行染色；

（1）從培養箱中取出分化后的MSC，每孔中的單層細胞用2ml A潤洗兩次；

（2）每孔中加入2ml福爾馬林，室溫固定單層細胞10min；

（3）吸出福爾馬林，每孔中加入2ml A潤洗兩次后，再用2ml蒸餾水潤洗一次；

（4）加入2ml ARS溶液，室溫孵育30min；

（5）過量蒸餾水潤洗各孔，直到“陰性”孔中的背景染色最大限度地清除；

7.用顯微鏡觀察標記為“成骨”的單層細胞評價深紅色的程度。成骨分化達到令人滿意的水平時，單層細胞ARS著色面積超過50%。此時，單層細胞可在4℃水中最多存放7天。或者，ARS可從著色的單層細胞中提取出來，用先前描述的方案進行測定。