HPLC良好的連接方略

毛細管對高效液相色譜分離的影響

若高效液相色譜 (HPLC) 系統采用了不適當的連接方式或者應用不正確的毛細管，均可能導致均可能導致不良的峰擴寬，色譜柱的最佳分離效率就更無從談起。甚至還可能發生使用的柱子越細，其洗脫峰的擴寬反而越大的情況。本文將詳細介紹毛細管對高效液相色譜分離的影響，以及如何選擇正確的毛細管與連接方式。

圖1. 為了達到最佳分離性能，即使是毛細管和管路連接也必須與HPLC系統相適配。

高效液相色譜柱良好的分離效率是HPLC成功分離的一個重要前提，不適當的管路連接或毛細管的使用不當，均可能導致不良的峰擴寬，因此需要特別注意。當使用4.6×250mm的“老式”標準分離柱時, 毛細管的作用和管路連接的影響還不是很突出;而當使用2.0×100mm的細徑色譜柱時，它們的影響就很大。

對于“Ex-柱”而言，造成峰擴寬的主要原因是管路連接中使用了錯誤的毛細管和空腔，它們會顯著擴張淋洗通道。因此原則上應盡可能采用窄小的柱徑，并縮短連接管路。

如果用戶使用的是由同一制造商供應的配套設備或緊密裝配型高效液相色譜儀，那么所有的管路連接已經由供應商預先優化了。這類設備出現問題的情況僅在于：需要聯接另外一家公司的檢測器時，或者需要用不同的組件來自行組裝一套HPLC系統時。

通過分離柱的峰寬度是與色譜柱的尺寸成正比的，簡言之：細柱產生窄峰。液體輸導產生的峰擴寬則會牽涉到整個系統，因而需要逐一協調。

泊肅葉定律

法國物理學家吉恩·倫納德·泊肅葉對血液循環系統生理學的興趣促成了他在1840年對液體在細管中的流體行為進行基礎性的實驗研究。在樣品和洗脫液之間不是形成一個直界面，而是層流的形式。在直徑為“dt”的管子內(高效液相色譜毛細管)流體的不同流速構成一個“U”型(如圖2所示)。

圖2. Jean Louis Léonard Marie Poiseuilles描述的液體在細管中的流體行為。 dT=內徑，U= 流速，U_MAX =最大流速，U_AVE =平均流速。

為了盡量減少峰寬，應選擇盡可能小的管道直徑。樣品分子有一種向流體邊界擴散的趨勢。假如沒有這個擴散，洗脫峰將是無限寬的，因為根據泊肅葉理論，流速在毛細管管壁處為零，因而樣品分子在這一點上將是極其緩慢地前行。而擴散的作用導致了樣品分子由管壁遷移到管子中部，因而，樣品峰得以在有限的時間內洗脫，并呈現有限的峰寬。

毛細管的優化

高效液相色譜系統可以有多種不同的安裝方式，那么，我們應該盡可能地縮短進樣器與色譜柱之間的連接?還是色譜柱與檢測器之間的連接?或者兩者均可?可是這是絕對不能隨意而為的。而且其應用程式還不能隨意推廣到任何一個高效液相色譜系統。下面的實驗將清楚地演示毛細管對其的影響。

實驗裝置

帶有10μl樣品環的Rheodyne7125注射器，UV檢測器設在254nm，色譜柱4.6×100mm使用的是5-μ柱材料，流速為1ml/min以及8μl樣品檢測池，這些都是“標準”高效液相色譜的條件。如果使用0.13 mm內徑的毛細管，色譜柱和檢測器之間的連接長度則對系統的影響不大。只要將毛細管的直徑加倍(這里用到0.25mm)，分離效率即隨連接長度的增加而顯著地降低(如圖3所示)。

圖3. 將毛細管直徑増大一倍(這里0.25mm)，分離效率隨連接長度的增加急劇下降。A：0.25內徑×5cm，B：0.25內徑×20cm，C：0.25 內徑×80cm。

小體積HPLC色譜柱

在使用細而短的色譜柱的情況下(例如 2.0×100mm，流量200μl/min),毛細管的影響甚至更具破壞性。若采用0.13mm內徑的毛細管和80cm的連接長度，能觀察到低于18%的峰展寬。如果使用0.25mm的毛細管，即使是5cm的短連接，分離效果已是明顯差了很多，而使用更長的毛細管則分離變得完全不可用了(如圖4所示)。

圖4. 使用細而短的色譜柱時，若用0.25mm的毛細管，分離效果隨毛細管的増長越來越差。A：0.25內徑×5cm，B：0.25內徑×20cm，C：0.25編號×80cm。

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分離小體積樣品

在高效液相色譜系統中，應用的HPLC色譜柱體積越小，毛細管的影響就越大。因此，在HPLC系統中如果不對其他組件(特別是它們之間的連接)進行優化，裝置一根微孔柱是沒有意義的。進樣器-色譜柱-樣品檢測池之間的線路連接對分離質量具有特別的重要性。