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如果基線噪音大或發生漂移(不穩)該怎樣處理。
基線噪音大或飄移一般與高背景本底電流有關,而使背景電流變大的因素很多。下面例舉一些有可能
引發HPLC-ECD系統背景電流變大的因素。而除了大的背景電流外，還有別的因素可引起噪音。千萬記住,
下面例舉的因素僅是一部分可能的因素,而且電化學電池本身不會產生特別的背景電流。背景電流是因分析條件,系統性能,已使用電化學電池的時間長短和處理電化學電池方法的不同而產生。
引發高本底電流的一般因素：
水！HPLC-ECD系統中使用的水非常關鍵,要求每厘米的阻抗必須大于或等于 18 兆歐姆。因而建議水要進一步的純化,通過一種被稱作洗水的過程。(參考ESA的技術說明"Water Polishing"文件目錄號:70-1668)制備樣品或制作流動相時使用了不純(或被污染)的化學藥品。樣品本身也許就是污染源。氧化鋁或在萃取時帶入的雜質有可能會進入HPLC系統,從而污染色譜柱和電極。
流動相中的電化學活性試劑(如:EDTA,TEA)。EDTA 是流動相中經常使用的一種試劑,用于螯合氧化的金屬離子,可降低本底電流。在電勢大于400毫伏時,這種化合物(EDTA)具有很高的電化學活性。
如果工作電勢大于400毫伏,流動相中就不能再使用EDTA而應改用檸檬酸鹽來代替。TEA(三乙醇胺)是用來改善色譜峰的峰形。這種添加劑會含有電化學活性的雜質,在高電勢時這種雜質會發生特別的氧化反應。
因此要用最小量的TEA,典型的用量小于100 L/L或者對HPLC的色譜柱沒有活性的用量。
系統中的不銹鋼管可能被腐蝕。進入系統的污染物或腐蝕處的臟物可能引起電化學電池受污染(淤塞)或本底電流變大。建議用不銹鋼管的用戶需定期鈍化系統管路或者換用PEEK管。PEEK管可直接從ESA購買。
如果脈沖阻尼器破裂,會有污染物進入系統,導致增大背景電流或壓力升高。
其它引起噪音或漂移的來源：
泵頭里有溶解于流動相中氣體。泵壓的波動通常與此有關。要確保流動相被很好的脫氣。把泵停下來,等壓力下降后,然后把泵清洗(purge)30秒。流動相在進入系統使用前要脫氣 (詳情見下面的第6點)
電化學電池中有溶解在流動相中的氣體。要確保流動相被充分脫氣。
帶清洗頭的電化學電池(如:5014B和 5041型電化學電池)在使用前可能沒有被很好的清洗。
安培法電化學電極(如:5040和5041型電化學電池)有可能在目標電極處有小的泄漏。這主要是由安裝墊圈和電極失誤造成的。要牢記電極不能裝的太緊,同時要確保在裝配前所有部件必須完全是干燥的。
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怎樣清洗電化學電極
參見技術說明"Prolonging Cell Performance"( 文件目錄號:70-5017)。 它包含文字指導和技術
說明以保障電化學電極在最好的狀態下工作。
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關閉系統時應注意什么
關閉電化學電極的電勢。 用適當的洗液清洗整個系統(看下面的注意)。在電化學電極關閉和泵中的液體停止流動時,并非系統中的所有設備都必須得斷電。如果系統需長期存放建議斷掉所有設備的電源。
注意：對于HPLC-ECD系統,設備的斷電程序因其需停機時間長短不一而不同。 下面是不同情況下合理的斷電程序
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停機一晚上
非梯度系統--如果每天都在用此系統,應讓ECD系統一直開著。在此情況下,關掉電化學電極并讓流動相以 0。1mL/min 的低流速循環(看下面的第4點)。
梯度系統--對于梯度系統你不能再循環。而應使A和B各以50%的量組成流動相并使其總流速為0。025mL/min運行系統, 流動相排到廢液中。
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長期停機
徹底沖洗系統以洗掉鹽類物質。建議使用的沖洗劑應與實驗時用的流動相一致,只是不再含有緩沖劑或鹽類添加劑(如有機溶液和水)。注意!如果水或低濃度的有機溶液留在HPLC系統中時間很長有可能發生霉變并導致別的一些問題。對于硅填料的反向柱,水可能導致在線柱停留20到30分鐘不能被使用。在沖洗完鹽后,建議用柱子的生產廠家推薦的保存液再沖洗柱子,然后取出柱子并蓋好蓋子以防柱子變干。
如果存放時間超過幾個月,系統也應封存好。
注意：大部分EC應用的緩沖液鹽濃度在50-100mM。如果沒有流動,便有鹽在 HPLC系統中沉淀。
此沉淀能引起高的背壓和鬼峰及其它問題。 另外,沒有有機溶液(如:甲醇)的水性溶液易長菌。為防止長菌,ESA推薦使用有殺菌作用的試劑如MB(產品號:70-1025)。
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為什么要用孔徑為0.22 m的尼龍過濾器過濾流動相和樣品
使用孔徑為0.22 m的過濾器有兩個主要原因。
第一個原因是要濾去流動相中微粒以減少柱子的堵塞機會。第二個原因是庫侖電化學電池里的工作電極是由多孔石墨制成的。石墨孔徑大約為 0。2 m。為防止多孔石墨被微粒堵塞我們強力推薦使用孔徑為0。22 m 的過濾器。另外,過濾器要放在電化學電池的前面,為保護電化學電池一定要在線過濾。過濾器不是很貴,如果被堵住很容易被更換。
過濾器架子(產品號: 70-0893)
石墨過濾膜(用于進樣器前)(產品號: 70-0898)
Peek過濾膜(用于進樣器后)(產品號:70-3824)
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可以讓加電勢的狀態處于"On"一晚上嗎
只要 HPLC-ECD 系統中的流動相(包含緩沖鹽)一直處于流動狀態是可以的。一些用戶讓系統運行,這取決于系統所需的平衡時間。若系統一直在運行,那么在跑樣品前不需要平衡時間。然而,如果晚間泵出了故障,而電勢依然加在沒有流動相流動的電化學電極上,必然會損壞電化學電極。
請注意,如果對靈敏度的要求不高,如果所需平衡時間很短,在不運行系統時,最好關掉電化學電極或者使加在其上的電勢為 0 mV 。這樣通過減少電化學電極的工作時間和工作電流就可有效延長電化學電極的壽命,尤其是需要運行在高電勢的情況下更應如此。
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當我的基線以周期性的方式發生波動時我該怎么做
當基線以周期性的方式波動時此基線可描繪成鋸齒狀。人們經常會將噪音問題歸罪于電化學電池。而事實上 EC 電化學電池很少引起這種周期性的噪音。大多數情況是這種噪音是由泵的問題引起的。可以通過測量鋸齒波噪音的峰頭和峰谷(或兩峰頭) 間的距離來檢測這種噪音是否由泵引起。先測出峰間距(設為D1),再把液相流速降為原來的一半后再測出峰間距(設為D2),如果D2與D1接近兩倍關系,就可斷定是泵出了問題。引發泵產生這種噪音的因素有很多,下面是四個最易產生的因素：
1、止回閥堵塞---參考泵的使用手冊
2、泵頭中有氣體---灌注和清洗(purge)泵系統,趕出其中的氣體
3、堵住了流動相的入口或管子入口
4、泵的局限性*
*注意:由于在設計上不同泵產生無脈動基線的能力不同,在進行高靈敏度測量時一定要注意。電化學檢測器比紫外檢測器對噪音更敏感,故適用于紫外檢測器的無脈沖基線的泵并不一定能適用于具有高靈敏度的EC檢測器的應用。為盡量減小基線波動噪音,應在泵后裝一個脈沖阻尼器,使基線更平穩。
小心！在裝脈沖阻尼器之前一定要先詢問泵的生產廠商。有些泵是不能裝脈沖阻尼器的。
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PH值會對電化學電極的響應有什么影響
在大多數情況下,低pH值(酸性環境)將能有效阻止有些分析物質被氧化。在低pH值環境,測量時物質氧化所需的電勢會比中性或堿性環境高。反過來也是對的,高的 pH 值或(堿性環境)將有利于分析物質的氧化。
注意：在大多數情況下低 pH 值環境是用來防止分析物質(如:兒茶酚胺)自氧化。千萬記住,選擇不同的pH值將會影響化學分離,尤其是用色譜柱洗脫時的順序。一般來講不要太注重pH值對電極較高響應的影響,而應保證在自氧化最小的情況使被分析物質得到有效分離。建立伏安曲線(CV 曲線)將有助于優化分析物質的響應。本文檔的#8問題包含有關伏安曲線的信息。
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我怎樣確定能產生最大響應的最佳電勢
注意:這一過程假設色譜條件不會變(如:能達到物質分離的一個穩定的色譜方法)。這一過程也要求操作者擁有電化學理論知識,懂得伏安曲線和操作Coulochem的基本知識。可參考Coulochem II操作手冊中6。3,6。4a,和6。4b有關動態伏安曲線的情況。
1、根據待分析物的情況設置HPLC-EC系統
2、打開電化學電極,給電極加電勢并要比文獻提供的待分析物所需電勢高出100 mV并讓它平衡
3、給沒有最優化的通道加電勢到-200mV(記住每次只能優化一個電極。設定電極的電勢為-200mV,基本可以消除正在該電極上氧化的物質)
4、做一次已知濃度的標準物質的進樣。
注意：標準物應是濃縮的(如:柱內有10到50 ng),但不要在或靠近檢測器的檢測限進行測定。 以你認為能產生最大響應的電勢跑一下此標準物將是非常重要的。
5、調整Coulochem上的增益或R值使你感興趣的峰落在你所選范圍的70~80%的區域內
注意：調整增益使峰變大并易觀察但不能超出量程范圍。一旦增益或R值被設定,那么在整個過程中它們都得保持不變
對庫侖陣列電化學檢測器(CoulArray)來說,會自動調節量程范圍,所以無需選擇。
6、接下來,加電勢到感興趣電極,并且電勢值要比前面進樣時低50mV。讓基線穩定下來并使檢測器自動歸零。
7、一旦基線穩定下來就可以進標準樣。確保色譜圖是完整的和可以接受的。記錄最終的高度和面積。
8、每次把電勢減少50mV重復上面的6和7直到看不見峰高和峰面積為止。
9、以峰高為Y 軸,所加電勢為X軸,分別畫出每種化合物的變化曲線。
10、在您的方法中,當電勢增加時,峰高和峰面積已達到最大,增加電勢不會再增加峰高和峰面積時,應選擇能達到最大面積時所需的最低電勢作為工作電勢(如:如果獲得最大峰響應的電勢為450, 500 and550mV, 選擇400mV為工作電勢)。
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對于我的電化學電極,pH操作范圍應是多少
對于大部分情況,操作環境的pH范圍在 1-12都不會損壞電化學電池或其部件。但是,當使用極端pH時,一定要多加注意。要意識到pH呈堿性和大的背景電流同時作用將損壞電化學電池。還有,色譜柱對pH值的限制要求也要特別注意。一定要確保色譜柱適于你的pH環境,否則,不適宜的pH將使色譜柱的填料有可能進入測量系統污染或損壞電化學電極。
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多久更換一次過濾膜
理想的色譜條件下過濾膜是不需要更換的,然而在實際中因其被堵塞,是一定要定期更換的。更換頻率視流動相和樣品中的顆粒物質進入系統的情況而定。
壓力的增大提示我們,或許是應換過濾膜的時候了。 建議每天使用系統時都要做壓力變化的日志。要檢查系統壓力開始升高是否是系統上的第一個過濾膜引起的。等待壓力的下降。在系統內還有壓力時不要拆除 HPLC 系統。斷開過濾器后面的管道,讓流動相流過過濾器。記錄此時的壓力后拆除過濾器,再記錄壓力值,然后用前面的記錄值減去此值。如果差值大于 8-10 bar(或 100 psi),就應換掉這個過濾膜。
用同樣的方式檢查其它的過濾膜。
注意！拆除過濾器前,一定要確保電化學電池被斷開和系統壓力低于10 bar。
如果過濾膜需更換的頻率過于頻繁,就要對系統進行進一步的檢查。可根據下面的方法確定堵塞過濾膜的顆粒來源。如果泵后面的過濾膜需經常更換,說明流動相(包括長菌)或泵的密封圈有可能出了問題；
如果進樣器后面的過濾膜需經常更換,說明樣品有可能有問題；如果柱子后面的過濾膜需經常更換,說明問題可能出自柱子。雖然記住這些將會得到解決問題的很好指導,但也不是絕對的。當處理 HPLC 系統的壓力問題時,一定要充分做好系統分析和邏輯思考,盡量想到各方面的可能性。
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我能用硝酸清洗電化學電極嗎
不建議用硝酸清洗電化學電極。只有在其它方法處理不再有效時,才用硝酸做電化學電極的最后一次清洗。 決不能讓色譜柱接觸硝酸。有關電化學電極的清洗說明請參見Coulometric Sensor Technical Note文獻號:70-1989。
當用硝酸處理電化學 電極時決不能給其施加電勢。用硝酸清洗電化學電極將使電化學電極的所有保修為無效。可用6N硝酸來清洗或鈍化EC-HPLC系統的不銹鋼件。有關用硝酸清洗電化學電極的指導說明可參見Coulochem II 操作手冊的8。5部分。 如果用硝酸鈍化HPLC系統中的不銹鋼件, 可參見Coulochem II 操作手冊的4。3部分。
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閥門的故障處理
造成兩次進樣所得的峰響應不太一致的原因可能是因進樣方法或進樣器有問題。