DSC在藥物分析中的應用

近年來，熱分析技術在制藥工業中的應用越來越廣泛，本文以案例的形式介紹了熱分析中的差示掃描量熱儀，在藥物純度、藥品多晶型分析、冷凍干燥工藝的優化、蛋白質變性的檢測等幾個方面的應用。

藥品研發與生產中，必須監控其物化性質，如純度、晶型、穩定性和安全性，以確保藥物具有預期的藥性。眾所周知，有機化合物包括藥品常常具有多種結構及晶態，這勢必影響到藥品的加工條件、期穩定性、衰變及生物投遞能力。藥品的最終組成中包含了多種活性組份以及它們之間相互作用而生成的產物，當然還有賦形劑、水分、藥片涂層等，十分復雜。因此對其全面的表征也變得越來越重要，其中最理想的測試方法之一就是熱分析。

熱分析具有用量少、方法靈敏、快速的特點，在較短的時間內可獲得需要復雜技術或長期研究才能得到的各種信息。差示掃描量熱儀（DSC）是目前在醫藥領域應用最廣的熱分析儀之一，DSC通過測量藥物熱焓和溫度隨程序溫控的變化，具體可以研究的信息如藥物純度，藥物的多晶及亞穩態、無定形態的研究，優化冷凍干燥，脂質檢測、蛋白質變性等。

藥物純度評估

DSC在藥物分析中最主要的應用之一是評估藥物純度。自從上世紀60年代商業化DSC出現以來，因DSC測定藥物純度快速、準確易于操作，這項技術已被廣泛接受。DSC池體的響應時間和溫度測量對于純度的準確分析至關重要。功率補償型DSC因其爐體小（<1g），響應時間極快，而且其使用鉑電阻測溫精度高、準確好，因而非常適合純度的準確測量。眾所周知，當物質中有微量雜質存在時，其熔點將會降低，同時熔程變寬。圖1顯示了不同純度的非那西汀（乙酰對氨苯乙醚）樣品的DSC曲線。

圖1.  不同純度非那西汀樣品的DSC熔融測試結果。

而DSC測定純度通過Van'tHoff 方程計算求得：

1/Fs=[ H/R]-[To–Ts]/To2?[1/X2]

式中Ts為樣品的瞬間熔解溫度，To為純物質的熔點（°K）；△H為純物質的熔融熱（J/g），X2為雜質樣品中的摩爾分數；R為氣體常數（8.314J/mole），Fs則為溫度Ts時樣品已熔化的分數，Fs=As/At，As為溫度為Ts時已熔融部分的熔融熱，At為總熔融熱。以Ts對1/Fs作圖，斜率為Rto2X2 /△H，而Y軸截距則為100%純物質的熔點To。

圖2為非那西汀樣品的純度分析。由PerkinElmer的純度軟度，依照Van't Hoff方程，即可求得其純度為99.96%。

圖2.   Pyris軟件根據Van’t Hoff方程計算的非那西汀樣品的純度結果。

藥品的多晶態分析

許多藥物都存在多晶現象，由于根據加工條件的不同，藥品可以存在2種以上的晶型。在熱力學上穩定性較差的晶型具有較低的熔點。因此一個具有多種晶型的藥物在熔融過程中可能存在多個熔點。更為復雜的是：當亞穩態晶型熔化后，可能會再結晶，然后在更高的溫度下熔融。

藥品的多晶現象對藥物的性質，如藥理、生物可利用率、有效壽命等有著至關重要的影響。不同晶型的藥品，其溶解和被吸收性能會有明顯的差異。因此可以通過控制晶型及該種晶型所占比例來控制藥物的存放時間、釋放時間及有效作用時間。隨著藥品存放時間的增加，有些易溶解的晶型會逐漸轉化為難溶解的晶型，從而改變藥物配方的藥物活性。因為上述原因，需要有一種方法能檢測藥物的多晶現象。差示掃描量熱儀由于其能準確地測量多種晶型的熔點及熔融熱，且能顯示整個熔融過程，發現各晶型的單變或互變現象（晶型轉變），非常適合于藥品的多晶分析。

圖3所示為對撲熱息痛片劑（乙酰氨基酚）的DSC曲線，在57.5℃處有一尖銳的吸熱峰，其熱焓值僅為0.82J/g，此轉變與撲熱息痛的多晶現象有關。起始溫度在168.2℃的峰為其主要晶型的熔融峰，熱焓高達155.0J/g。圖3中的插圖為57.5℃處亞穩晶型的放大DSC曲線，除該吸熱峰處還存在一較寬溫程與之疊加的吸熱峰，應為撲熱息痛藥片中少量水份的揮發。

圖3.  未處理的醋氨酚的DSC測試結果。

將上述藥品冷卻到室溫后再次以10℃/min加熱，所得曲線見于圖4，與圖3相比，DSC結果出現顯著差異。在80.0℃和131℃出現兩個結晶峰,放熱量分別為102J/g和7.5J/g，熔融峰出現在155.1℃，由此可見熱歷史的不同將嚴重影響藥品的多晶組成，進而影響藥品的理化性質。

圖4.  冷卻后再加熱的醋氨酚的DSC測試結果。

冷凍干燥工藝的優化

許多藥品在生產過程中需要將活性物質的水溶液在不破壞組成、結構的前提下，進行冷凍干燥（凍干法）以便延長儲存時間或使用中能與水重新組成試劑。凍干過程包括兩個步驟：冷凍原水溶液, 抽真空使吸附水揮發。從能源消耗角度考慮，需要知道最高的可以接受的冷凍溫度，同時為了確保所凍干藥品保持原有的物化性能、藥理效果，又要求冷凍干燥的溫度足夠低，不至于破壞藥品結構與組成。

在藥品溶液冷凍干燥過程中，溶質相可能形成無定形的濃縮相，并且具有特征的玻璃化轉變溫度（Tg），也可能形成共晶體，加熱晶化藥品至其共熔點將導致藥品的熔化或回熔。

考慮到上述溶質相非晶態及結晶態在冷凍過程中的形成，評價與之相類的配方組成，就成了優化凍干工藝條件的前提。對于形成無定型濃縮相的組成。其關鍵參數為低溫下的玻璃化轉化溫度（Tg）。通常情況下，凍干溫度應低于Tg，以避免凍干加熱過程中破壞樣品結構。因此，精確、準確、靈敏地檢測樣品在低溫下的Tg及重結晶轉變，在冷凍干燥工藝設置中就變得尤為重要。

圖5為5%蔗糖溶液經-80℃冷凍2min后，升溫掃描DSC曲線（10℃/min，-80℃~20℃），在冰的熔融峰之前，-35℃左右處還存在一微弱平緩的放熱峰，這個結果很難解釋。眾所周知，蔗糖溶液在此溫度范圍存在一個玻璃化轉變過程。為了澄清上述常規DSC所得結果，對上述樣品采用分步掃描DSC（StepScan DSC）進行分析，方法顯示于圖6，結果見于圖7。

圖5.   5%蔗糖溶液常規 DSC 測試結果。

圖6.  采用分步掃描DSC（StepScan DSC）循環升溫等溫的測試方法。

圖7.   5%蔗糖溶液采用分步掃描DSC（StepScan DSC）的測試分析結果。

StepScanDSC是一種新型的用于PerkinElmer功率補償型DSC上的軟件，該方法采用傳統的測量物質比熱（Cp）的方法，未實現最可靠的量熱結果。它的加熱冷卻方式為分段式加熱（冷卻）-保溫-加熱（冷卻）。該方法可直接獲得比熱（Cp）數據，并可在不降低分辨率的前提下提高靈敏度，還可分離熱現象中的可逆與不可逆現象。如可逆的玻璃化轉變過程中，不可逆的應力釋放或水份揮發，可逆的熔融過程中不可逆的組份的分解。當然要實現上述很窄溫度區間內的升溫-保溫-升溫過程，如10℃/min升溫2℃，然后保持200s，然后再10℃/min升溫2℃，保溫200s，多次重復，不僅需要軟件操作，更需要硬件上的支持，要求爐體要有極快的響應時間，精確的控溫能力，PerkinElmer的功率補償型DSC，具有一對質量小于1g的鉑銥合金爐體，升降溫速率可高達500℃/min，而且如此100℃/min的加熱速率升溫，溫度過沖小于0.1℃，因此可滿足StepScanDSC的要求。

圖7中，最上方鋸齒型譜圖為StepScanDSC原始結果，中間的譜線代表了不可逆熱變化，與圖5中標準DSC所得結果相似，有一放熱峰。最下方譜線反映了樣品的可逆熱轉變，從中可清楚地看到該樣品在-32℃及-52℃處存在兩個玻璃化轉變。其中，在-33℃的轉變被認為可能造成結構的破壞。因此，凍干溫度必須低于此溫度。

蛋白質變性的檢測

隨著熱分析在生化領域的應用，采用高靈敏度的DSC研究蛋白質溶液的熱性能變得越來越重要。在水溶液中，蛋白質具有特定的三維結構以支持特殊的生物功能，而一旦蛋白質被加熱，分子運動就會破壞這種結構（熱變性作用）。變質過程伴隨著非常微弱的能量變化，高靈敏度的DSC可檢測到這種轉變。

圖8為5%蛋白質溶液的DSC曲線，這種蛋白質在72.6℃（峰頂溫度）附近有一個很寬的吸熱峰，此吸熱峰即代表了該物質的受熱變質。可見DSC可方便快捷地檢測蛋白質的熱穩定性。這對抗病毒藥品開發及研究非常重要。

圖8.  蛋白質受熱變性的DSC測試結果(5%溶液)。

綜上所述，熱分析技術尤其是差示掃描量熱儀在藥品檢驗中有著廣泛的應用，在新藥研制、中間體檢測、最佳配方的選擇、藥物穩定性的預測、藥物質量優劣的評價等方面，起著舉足輕重的作用。