DNA聚合酶作用部位是磷酸二酯鍵。
1、聚合作用：在引物RNA-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令，即A與T，C與G的配對原則，逐步逐個、連續地將dNTP加到延伸中的DNA分子3'-OH末端，逐步合成延長中的子鏈DNA。這是DNA聚合酶的主要作用；
2、3’→5’'外切酶活性（校對作用）：這種酶活性的主要功能是從3’→5’方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸，3’→5’外切酶活性的主要功能是校對作用。
當加入的核苷酸與模板不互補而游離時則被3’→5’外切酶切除，以便重新在這個位置上聚合對應的核苷酸，可見，3’→5’外切酶活性對DNA復制真實性的維持是十分重要的。以保證復制過程的保真性和準確性；
3、5’→3’外切酶活性（切除修復作用）：該活性是從5’→3’方向水解DNA延長鏈前方的DNA鏈（即只對DNA上雙鏈處的磷酸二酯鍵有切割作用），主要產生5'—脫氧核苷酸。這種酶活性在DNA損傷的修復中可能起著重要作用。
