DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳原理和操作步驟

原 理

瓊脂糖凝膠電泳是重組DNA研究中常用的技術，可用于分離，鑒定和純化DNA片段。不同大小、不同形狀和不同構象的DNA分子在相同的電泳條件下(如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等)，有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。凝膠中的DNA可與熒光染料溴化乙錠(EB)結合，在紫外燈下可看到熒光條帶，籍此可分析實驗結果。

操作步驟：

1. 將凝膠成形模具兩端用醫用膠布封好，水平放置，將選好的梳子放好，梳子底部與模具之間留1mm空間。

2. 稱取DNA電泳用瓊脂糖0.8g放入250ml的三角燒瓶中，加入100ml 1×TAE緩沖液，混勻后，將燒瓶置于電爐上，加熱煮沸，直至瓊脂糖完全溶解。

3. 關閉電爐，取下三角燒瓶，將其置室溫下冷卻至70℃左右(手握燒瓶可以耐受)，再加入溴化乙錠(10mg/ml)5μl，混勻后，即將凝膠溶液倒入膠板鋪板。本實驗所用制膠板約需膠液100ml。

4. 室溫下待凝膠完全凝固，需時約30分鐘，揭去二端膠布，拔出梳齒，將膠板放入電泳槽中。

5. 在電泳槽加入1×TAE緩沖液，以高出凝膠表面2mm為宜。

6. 取Ep管三支，標號，如下表所示準備電泳樣品

7. 將上面三管樣品置震蕩器上混勻，短暫離心。

8. 用加樣器吸取樣品。依序分別加入三個點樣孔中，注意加樣器吸頭應恰好置于凝膠點樣孔中，不可刺穿凝膠，也要防止將樣品溢出孔外。

9. 接通電源，調節電壓至50伏，電泳90分鐘后，將凝膠板取出，在紫外燈下觀察結果。

注：1. 細菌噬菌體λDNA全長49.01kb，其序列及酶切位點已研究清楚，它經不同的限制性內切酶消化后可產生不同的電泳帶圖譜。因為每條區帶的DNA長度是已知的，所以被選為基因工程中常用的DNA分子大小標準，與其進行比較計算，即可得到待測DNA片斷的長度，λDNA經HindⅢ消化后產生7條區帶，依次為23.7；9.46；6.75；4.26；2.26；1.98；0.58(kb)

2. 溴化乙錠為一種有毒試劑，使用時一定要戴手套操作，注意防護。

儀器與器材

1．電泳儀2．平式核酸電泳槽3. 紫外燈

試劑與材料：

1. 瓊脂糖

2. 6×點樣緩沖液：0.25%溴酚蘭、40%蔗糖

3. DNA分子量標準：λDNA分子量標準：λDNA/HindⅢ

4. 50×TAE電泳緩沖液貯存液配方：(50×)每升

242g Tris， 57.1ml冰醋酸， 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

1×緩沖液濃度：0.04mol/L Tris HAc、0.002mol/L EDTA

5. 0.8%瓊脂糖：0.8g瓊脂糖用100ml 1×TAE沸水浴溶解

6. 10mg/ml EB 1.0g 溴乙錠100ml 三蒸水

附注：

影響DNA片段瓊脂糖電泳的幾個因素：

1. DNA分子的大小：線性DNA分子的遷移率與其分子量的對數值成反比。

2. 瓊脂糖濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移率是不相同的。相反，在一定濃度的瓊脂糖凝膠中，不同大小的DNA片段的遷移率也是不同的。若要有效地分離不同大小的DNA，應采用適當濃度的瓊脂糖凝膠。

3. DNA分子的形態：在同一濃度的瓊脂糖凝膠中，超螺旋DNA分子遷移率比線性DNA分子快，線性DNA分子比開環DNA分子快。

4. 電流強度：每厘米凝膠電壓不超過5V，若電壓過高分辨率會降低，只有在低電壓時，線性DNA分子的電泳遷移率與所用電壓成正比。