【摘要】 目的 建立芍藥湯中鹽酸小檗堿含量的測定方法。方法 采用高效液相色譜法,色譜柱：Agilent XDB C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液-三乙胺(30∶70∶0.14);流速：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃;檢測波長：345 nm。結果 鹽酸小檗堿在0.07～1.40 μg范圍呈良好的線性關系,平均回收率為98.63%, RSD=1.21%(n=6),鹽酸小檗堿的平均含量為1.55%。結論 本法準確、靈敏、重復性好,為芍藥湯的質量控制提供了依據。
【關鍵詞】 芍藥湯;鹽酸小檗堿;高效液相色譜法;含量測定
Abstract：Objective To determine the content of berberine hydrochloride in Shaoyao decoction. Methods HPLC was performed on an Agilent XDB C18 column by using acetonitrile-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate-triethylamine (30∶70∶0.14) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min, the column temperature was 25 ℃ and the UV detection wavelength was 345 nm. Results Berberine hydrochloride showed a good linearity redationship in the range of 0.07～1.40 μg. The average recovery was 98.63% (n=6, RSD=1.21%). The average content was 1.55%. Conclusion The method is simple and accurate, with good repeatability, and can be used for the quality control of Shaoyao decoction.
Key words：Shaoyao decoction;berberine hydrochloride;HPLC;content determination
芍藥湯出自《素問病機氣宜保命集》[1],由芍藥、當歸、黃連、黃芩、檳榔、木香、甘草、大黃、肉桂等9味中藥組成,具有清熱燥濕、調和氣血的功效,主治濕熱痢疾。芍藥湯為治療潰瘍性結腸炎的常用方劑[2],但目前對其有效成分及質量標準研究較少,僅有報道對其所含芍藥苷的含量進行測定[3]。黃連、黃芩為方中君藥[1],黃連有效成分為小檗堿,因此,本研究將鹽酸小檗堿作為該復方的主要有效成分,建立了高效液相色譜(HPLC)法測定芍藥湯中鹽酸小檗堿含量的方法。結果表明,該方法簡便、準確,重復性好,為芍藥湯的質量控制提供了依據。
1 儀器與試藥
高效液相色譜儀：Agilent HPLC 1100色譜儀(G1311A四元泵,G1313A自動進樣器,G1316A柱溫箱,G1315B DAD檢測器,HP化學工作站);Sartorius CP 225D電子天平。
鹽酸小檗堿標準品(中國藥品生物制品檢定所提供,批號110713- 200910,供含量測定用);方中所用藥材均購自北京豐泰金源藥業有限公司,并由中國中醫科學院中藥研究所胡世林研究員鑒定,均為2005年版《中華人民共和國藥典》(一部)收載的正品。乙腈(色譜純,Fisher 公司);其他試劑為分析純;水為娃哈哈純凈水。
2 方法與結果
2.1 色譜條件
色譜柱：Agilent XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液-三乙胺(30∶70∶0.14);流速：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃;檢測波長：345 nm。
2.2 方藥的提取
按處方稱取各味中藥,放入煎煮器中,采用傳統水煎方法提取2次,加水量分別為6、4倍,每次煎煮30 min,合并煎煮液,濃縮,真空干燥成干膏粉,備用。
2.3 對照品溶液的制備
精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量,加鹽酸-甲醇溶液(1∶100)制成每1 mL含70 μg的溶液,即得。
2.4 供試品溶液的制備
取芍藥湯干膏粉(過4號篩)約50 mg,精密稱定,精密加入鹽酸-甲醇溶液(1∶100)30 mL,稱定重量,超聲提取(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用鹽酸-甲醇溶液補足減失的重量,搖勻,過濾。濾液濃縮后移置10 mL量瓶中,用鹽酸-甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過,取續濾液,即得。
2.5 線性關系考察
精密吸取上述對照品溶液1、3、5、7、9、11、20 μL進樣分析,測定峰面積。以進樣量對峰面積積分值進行回歸處理,得回歸方程：Y=2 513.5X-32.56,r=0.999 9,鹽酸小檗堿在0.07～1.40 μg呈良好的線性關系。
2.6 精密度試驗
精密吸取同一份供試品溶液5 μL,按上述色譜條件進行分析,重復進樣6次,峰面積RSD=0.33%,表明儀器精密度良好。
2.7 穩定性試驗
取供試品溶液1份,室溫放置,分別于0、1、2、3、4、5、6 h進樣5 μL,按上述色譜條件進行分析,其峰面積RSD=0.61%,表明供試品溶液在6 h內穩定性良好。
2.8 重復性試驗
按“2.4”項下方法制備供試品溶液6份,分別吸取5 μL,按上述色譜條件進行分析,測定峰面積并計算含量,結果供試品中鹽酸小檗堿平均含量為1.55%,RSD=1.14%。表明重復性良好。
2.9 加樣回收率試驗
采用加樣回收法。取已知含量的芍藥湯干膏粉約50 mg(約含鹽酸小檗堿0.775 mg),精密稱定,共取6份,分別精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液(0.194 mg/mL)4 mL,按“2.4”項下方法制備供試品溶液,分別吸取5 μL,按上述色譜條件進行分析,測定峰面積并計算含量,結果平均回收率為98.63%,RSD=1.21%。見表1。表1 加樣回收率試驗結果(略)
2.10 樣品測定
精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,測定峰面積,計算供試品中鹽酸小檗堿的含量。色譜圖見圖1;含量測定結果見表2。表2 樣品測定結果(略)
3 討論
本研究對芍藥湯供試品的制備方法進行了優選,采取水煎液、水煎液蒸干甲醇溶解、水煎液制成干膏粉甲醇超聲提取3種方法制備樣品,結果表明,采用水煎液制成干膏粉甲醇超聲提取方法制成的供試品溶液中鹽酸小檗堿的百分含量明顯高于其他方法。
本研究對儀器分離條件進行了優選。對鹽酸小檗堿進行紫外全波長掃描,發現在250、280、340 nm左右有3個吸收峰值,選取254、280、340、345、350 nm進行檢測,發現在345 nm波長處鹽酸小檗堿的峰面積均大于其他波長,故選擇345 nm作為檢測波長。在色譜柱的選擇上,我們選用Agilent SB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent Extend C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)進行測定,結果表明,Agilent XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱在峰形、塔板數、保留時間等方面均優于其他色譜柱。本研究還對流動相與柱溫進行了篩選,流動相選擇了乙腈-0.2 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(25∶75)、乙腈-0.033 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(30∶70)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(30∶70)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液-三乙胺(30∶70∶0.14)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(每1 000 mL水溶液加SDS 1.7 g)(30∶70)進行試驗,結果顯示,乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液-三乙胺(30∶70∶0.14)分離效果最優。在柱溫上本實用選擇了25、35 ℃進行比較,最后選擇柱溫25 ℃進行分離。
我們對提取溶媒進行了篩選,比較了水、75%乙醇、95%乙醇、甲醇、鹽酸-甲醇(1∶100),結果鹽酸-甲醇 (1∶100)作為溶媒時鹽酸小檗堿含量明顯高于其他溶媒。在對提取溶媒用量、提取方法與提取時間進行篩選上,采用冷浸、回流、超聲波法,經過優選,采用鹽酸-甲醇(1∶100)30 mL超聲提取0.5 h作為樣品的提取條件。
【參考文獻】
[1] 李 冀.方劑學[M].北京：中國中醫藥出版社,2006.131.
[2] 趙曉霞,郭 勝,李寶鶴,等.芍藥湯對潰瘍性結腸炎大鼠ICAM-1、TNF-α、IL-10影響的實驗研究[J].中國中醫藥科技,2008,15(3)：174.
[3] 魏玉明.高效液相色譜法測定芍藥湯中芍藥苷的含量[J].中醫藥學刊, 2005,23(12)：2272.