樣品前處理
1. 標準曲線的配置
配置濃度為1.0mg/ml L-抗壞血酸的標準儲備液,配置成5μg/ml,50μg/ml, 100μg/ml, 250μg/ml ,500μg/ml標準曲線(標曲濃度請根據自己樣品合理選擇),用20g/L偏磷酸溶液定容至刻度,臨用現配。
圖一 本次選擇了這一款標準品
2.樣品溶液的制備
2.1 稱取研細后樣品0.5g于50ml容量瓶中,加入適量20g/L偏磷酸溶液,超聲15min,并定容至刻度。此處直接用中速濾紙過濾了,沒有離心,過濾速度不比離心慢多少。
2.2 用大肚吸管吸取20mL上述離心后的上清液于50mL離心管中,加入10mL40g/L的 L-半胱氨酸溶液,用100g/L磷酸三鈉溶液調節pH 至7.0~7.2,以200次/min振蕩5min。 再用磷酸調節pH至2.6(標準為2.5~2.8),用水將試液全部轉移至50mL容量瓶中,并定容至刻度。 混勻后取此試液過0.45μm 水相濾膜后待測[由此試液可測定試樣中包括脫氫型的 L(+)-抗壞血酸總量]。
若試樣含有增稠劑,可準確吸取4mL經 L-半胱氨酸溶液還原的試液,再準確加入1mL甲醇,混勻后過0.45μm 濾膜后待測(本次樣品不含增稠劑,故此忽略此步驟)。
色譜分析過程
色譜條件的選擇
色譜柱:迪馬鉆石一代C18 250×4.6mm 5μm
檢測器:紫外檢測器,分析波長245nm。
流動相:A:6.8g磷酸二氫鉀和0.91g十六烷基三甲基溴化銨,用水溶解并定容至1L用磷酸調pH 至2.5~2.8);B:100%甲醇。 按 A∶B=98∶2混合,過0.45μm 濾膜,超聲脫氣。
流速:0.9ml/min
柱溫:25℃
圖二 樣品
圖三 標準曲線
注意事項
這個實驗過程中要戴好手套,注意安全,十六烷基三甲基溴化銨毒性是很不好的。
十六烷基三甲基溴化銨很輕且易產生氣泡,配置流動相時會有一些飄在水面上與泡沫混在一起,很難發現,請多超聲一些時間,務必保證全部溶解。