飛行時間質譜技術與絲狀真菌

　　侵襲性真菌感染是重癥監護和器官移植患者死亡的高風險因素，其早期診治對提高救治率至關重要。其中，絲狀真菌是侵襲性真菌感染的主要病原菌之一，但絲狀真菌生長緩慢（一般需要5～7d）限制了早期診斷，絲狀真菌的早期鑒定與耐藥性增強已成為臨床救治的重大難題。目前，絲狀真菌常用的鑒定方法為鏡檢和菌落形態聯合鑒定，但不足之處是易受檢驗人員主觀判斷影響。

　　MALDI-TOF MS 技術的鑒定原理

　　MALDI-TOF MS 技術是近幾年發展起來的，用于臨床分離病原菌全細胞鑒定的軟電離技術，其主要是針對菌種特異性核糖體蛋白進行檢測，具有操作簡單、快速、準確等優點。

　　MALDI-TOF MS 主要由MALDI 和TOF 兩部分組成。

　　MALDI技術的工作原理：激光照射樣品蛋白與過飽和的基質溶液形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量并與樣品蛋白解吸附使樣品電離，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，從而使生物分子電離。

　　TOF的工作原理：不同質荷比（m/z）的離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的時間不同，獲得細菌特異的質譜指紋峰圖。將該峰圖與標準數據庫圖譜進行比對，根據匹配結果進行判讀。分值越高，匹配效果越好，準確度越高。鑒定結果的評分范圍0～3.0，數值＞2.0 表明鑒定結果可達到菌種水平，1.7～2.0 表明鑒定結果僅達到菌屬水平，＜1.7 為未達到菌屬水平，結果不可信。

　　由于微生物菌種或菌屬存在不同程度的種內差異，如核苷酸順序、生化反應、指紋圖譜類型等，因此，數據庫指紋圖譜應該足夠全面。

　　MALDI-TOF MS 技術鑒定絲狀真菌的前處理

　　絲狀真菌的鑒定準確性較差，且由于細胞壁厚和形態特征變化大，診斷方法一直難以突破。MALDI-TOF MS技術鑒定絲狀真菌基本步驟包括點靶、前處理、上機，其中難度最大的是絲狀真菌的前處理，即破壁。前處理也是影響絲狀真菌鑒定效果的主要因素。絲狀真菌細胞壁厚，為100～200 nm，且細胞壁的韌性和穩定性都較強，普通的前處理方式難以奏效。Vermeulen 等分析了MALDI-TOF MS 技術鑒定完整絲狀真菌細胞和裂解后細胞的效果，結果顯示，細胞裂解法明顯優于完整細胞法。

　　De Carolis 等通過對103 株絲狀真菌（曲霉菌、鐮刀菌、毛霉目菌）運用真菌孢子和水混合直接點靶的完整細胞法處理，使用MALDI-TOF MS技術進行鑒定，發現94株已知菌中，91株能鑒定到菌種水平。同樣，Nenoff 等使用完整細胞法對285株皮膚真菌（紅色毛癬菌、毛孢子菌等）的研究顯示，78.2% 的絲狀真菌可以鑒定到菌種水平。

　　細胞裂解法目前主要包括磁珠破碎法、海沙/丙酮  -乙醇/甲酸乙腈提取法和旋轉培養法等。

　　磁珠破碎法的優點在于可以對絲狀真菌充分研磨從而達到破壁效果，缺點在于操作比較繁瑣。2008年Hettick等運用磁珠破碎法對12株青霉菌樣本進行分析，結果顯示，該方法對青霉菌鑒定的準確率達到100%。此外，12株曲霉菌屬和5株不同的黃曲霉菌的鑒定結果表明其可以達到菌種水平的準確鑒定。該方法具有很高的重復性，Lau等 采用磁珠破碎法對421株固體培養基上生長的絲狀真菌鑒定，結果顯示，菌種和菌屬的鑒定準確性分別達到370（88.9%）株和388（93.2%）株。

　　另外一種破壁的方式是甲酸乙腈前處理，也是臨床實驗室最常用的方法。Schr?dl 等 對4株不同的橫梗霉進行甲酸乙腈提取法處理，實現了在菌種水平100%的準確鑒定率。Bille等在甲酸乙腈提取法的基礎上進行了簡化，將64株曲霉菌的孢子或菌絲與靶板上甲酸乙腈（1μl 70%）預混后對細胞進行裂解，使用該裂解方法檢測準確率可以達到86%，與Iriart等應用甲酸乙腈提取法鑒定44株曲霉菌的效果（81.1%)相當，甲酸乙腈提取方法同樣適用于絲孢菌屬、鐮刀菌屬、橫梗霉菌屬和皮膚癬菌的鑒定。

　　最后一種方式是旋轉培養法，該方法可以得到均一的菌絲體，有利于絲狀真菌細胞壁的破壞。黃艷飛等運用旋轉培養法對380株絲狀真菌培養鑒定，其鑒定菌屬和菌種的準確率分別為94.0%和76.0%。因此，實驗室在鑒定絲狀真菌時可以根據自身實驗室條件和實驗需要選擇合適的前處理方法，從而達到滿意的鑒定結果。