非洲粟酒裂殖酵母的轉化實驗

細胞

腺嘌呤 亮氨酸 LiAc

YEA 平板

1. 在 YEA 平板上培養細胞直到長成可見單菌落。

2. 接種單菌落到添加有 150 mg/L 腺嘌呤、亮氨酸和/或尿嘧啶等營養缺陷互補物的 YEA 或 PM 培養基中，于允許溫度以 200 r/min 振蕩培養防止酵母菌沉積，使細胞滴度達到每毫升 5X10⁶ 到 1X10⁷ 個細胞。

3. 1000~2000 g 離心 5 分鐘，用滅菌蒸餾水洗一遍。

4. 用過濾除菌的 0.1 mol/L CH₃COOLi，pH 4.9 洗一遍。

5. 重懸于 0.1 mol/L 的 LiAc 使細胞滴度為每毫升 10⁹ 個細胞，取 100 μl 等份轉移到微量離心管中，在允許溫度孵育 60 分鐘。

6. 加 1 μg 溶于 15 μl TE 中的質粒 DNA，輕輕旋轉混勻，于允許溫度孵育 60 分鐘。

7. 加 290 μl 預熱到允許溫度的 50% PEG3350，輕輕旋轉混勻。于允許溫度孵育 60 分鐘。

8. 于 42℃ 熱休克 15 分鐘，允許溫度下使細胞恢復 10 分鐘。9000 r/min 離心 2 分鐘沉淀細胞。

9. 用 1 ml 非選擇性基本培養基重懸細胞，轉移到 10 ml 非選擇性基本培養基中。于允許溫度孵育 30 分鐘，劇烈振蕩以保持細胞的懸浮狀態。然后置于室溫不搖孵育 30~90 分鐘。

10. 2000~4000 g 離心 10 分鐘沉淀細胞，重懸于合適體積的選擇性基本培養基中涂板，平板為 PM。