長期被誤解非編碼RNA存在“認知黑洞”

在人類基因組中95%的基因并不編碼蛋白質，其他物種也有大量的非編碼基因。這些DNA不會被編碼成蛋白質，卻又會轉錄出非編碼RNA，它們對生命活動起什么作用？是進化的冗余還是神秘的緩存？

《細胞》雜志近日刊登中國工程院院士曹雪濤團隊的研究論文，他們發現一種全新非編碼RNA分子。該分子能夠調控免疫系統的“進”與“退”，這是此前學術界從未認識和證明的。

“由于長鏈非編碼RNA（lncRNA）豐度低，業界對其功能爭議很大。”浙江大學生命科學研究院教授徐平龍在此前接受采訪時評價道，但此次發表的研究嚴謹地鑒定了所發現的一種全新lncRNA是有功能的，即能夠進行免疫調控，而曹雪濤院士正是這一機制的主要開拓者之一。

大海撈針 從浩淼細胞中層層篩選而出

細胞雖小，卻瀚如乾坤。尋找一個不知道存不存在的RNA分子，如大海撈針。

到哪里找線索？病毒感染給了曹雪濤啟示。談到為什么會從病毒這個“敵人”的角度考慮。曹雪濤講道：“我們中國文化講，陰中有陽、陽中有陰，這是外國人很難理解的。這一哲理指導我們對免疫系統的理解就是，激活和抑制很可能會交融在一處，那么我們就從這個‘交融點’突破解題。”

既然體內蛋白能夠識別外來的病毒RNA，能不能識別體內自身RNA呢？

科學界大部分認為不能。“免疫系統擁有識別‘自我’‘非我’的能力，就好像邊境衛士，對外來的侵害反應敏感，對轄內‘居民’熟視無睹。”曹雪濤院士團隊成員之一、中國醫學科學院基礎醫學研究所教授姜明紅說，“但是曹老師并不這么看，他說，究竟是不是熟視無睹，你要證明才行。”

在中國傳統哲理思想的指引下，曹雪濤鎖定了一個已知的關鍵蛋白——“RIG-I”，求證這個能與病毒RNA結合的蛋白，會不會和體內自身的RNA分子結合。

RIG-I很像一個分子水平的“老鼠夾子”，2011年有科學家解析了這個蛋白的分子結構，發現“老鼠（病毒RNA）”沒來的時候，夾子合著，兩頭的結構域相互作用，蛋白處于“閉合”狀態；一旦“老鼠”來了，與夾子的一頭結合，另一頭就會“彈開”，蛋白遂處于激活狀態。而這樣的構象變化，會引發細胞合成出關鍵的抗病毒分子——干擾素，干擾素分泌后被周圍細胞接受，引發抗病毒的“連鎖反應”。

研究團隊通過紫外加強RNA結合蛋白免疫沉淀（UV-RIP）的方法，將“老鼠夾子”和它獵捕的“老鼠”同時從細胞中分離出來。隨后通過蛋白質變性等方法，把“老鼠夾子”過濾掉，就獲得與RIG-I結合的所有RNA。

夾子“釣”上來的所有RNA中，有沒有未被發現的有功能的lncRNA呢？

將“撈針”的范圍鎖定夾子“釣”上來的RNA后，團隊又通過設計對應的干擾實驗繼續縮小范圍，即看究竟哪個RNA被封殺之后，免疫活動不再被抑制。功能篩選幫助團隊鎖定了一批備選者并列出“排名”。排名靠前的RNA分子，且與特定信號通路相關的lnc-Lsm3b被鎖定，一個新的RNA分子從浩淼的小鼠巨噬細胞中經過層層篩選被“打撈”上來，并獲得了確切的序列。

團隊后續開展了多角度的證明工作，如通過干擾、敲除、過度表達等技術，反復證明lnc-Lsm3b能夠在病毒感染的細胞中，通過“分子誘餌”的方式鎖定RIG-I，使其不與病毒RNA結合。

海量實驗 頂級期刊的尖銳難題被逐個攻克

全新的發現，使得團隊興奮異常。沒想到的是，更大的磨礪還在后面。

團隊向頂級期刊投稿，審稿人卻要求必須用CLIP（交叉互連免疫沉淀）技術明確RNA的哪一個點和蛋白質相互作用，連接在一起。用語言很難解釋蛋白質和RNA在活體細胞內錯綜復雜的關聯，姜明紅給科技日報記者畫圖：一個長鏈RNA會結合多個蛋白，這些蛋白有的是特異連接，連得緊密，有的就是“掛”在上面，而蛋白之外還會帶上其他的RNA，“纏繞”“連帶”“虛實”……

CLIP很難做，國內實驗室極少有成熟的經驗。收到修改意見后的團隊成員開始大量查閱論文。“國外的實驗流程無法完全照搬，不同的細胞做法不同，需要重新摸條件。”團隊中主要攻關這一技術的劉倫說。

CLIP技術和RIP（RNA結合蛋白免疫沉淀）技術類似，但是卻能夠達到單個堿基的分辨率。為此，通過海量實驗，針對裂解液的成分如何影響細胞內物質，團隊開始了如指掌；不同RNA酶的脾氣也熟練掌握。

“實驗室的部分我們自己攻克了，但是測序公司表示無法進行匹配的測序工作，原因是無法合成特有的適當引物。”劉倫說，國內沒有公司生產CLIP所需引物，而RNA測序必須先反轉錄為cDNA才能夠進行，引物決定了反轉錄的準確性，決定了目標位點能否確定。實驗室自己擔負起RNA轉錄、構建cDNA文庫的工作。完成3代測序、用化學方法測量分子間的相互作用力……這些免疫研究實驗室原本并不擅長的難題被團隊逐個攻克。

按圖索驥 摸索并掌握一套獨有技術體系

根據已有發現，團隊按圖索驥，利用分子篩層析實驗證實缺失lnc-Lsm3b表達的巨噬細胞在感染病毒以后，多聚化的RIG-I蛋白顯著增加。他們推測，病毒RNA與RIG-I結合以后，能夠誘導RIG-I單體形成多聚化狀態，從而激活下游信號通路。而lnc-Lsm3b只與單體結合，可能是通過抑制RIG-I的多聚形成抑制RIG-I的活性。

“Lsm3b只能結合單體的RIG-I蛋白、一條鏈能結合9個蛋白、結合力比病毒RNA高……”這些都是對這個全新RNA分子的多角度了解。

如同向“黑洞”中打進一束光，曹雪濤團隊在對現有知識體系顛覆的同時，肯定地回答了學界之前關于這類自身RNA分子是否存在、功能幾何的爭議。

“過去我們用別人的技術進行實驗，現在我們自己摸索并掌握一套獨有的技術。”曹雪濤說，整個研究的“練兵”不僅拓展了人類的“知識域”，還拓展了實驗室的思路和眼界。接到《細胞》雜志編輯部發來修改要求時感受到的“不可思議”和巨大壓力，團隊成員現在已能笑談。