重構工業菌讓“細胞工廠”綠色高效

對于工業細菌大腸桿菌來說，三羧酸循環（TCA循環）在其有氧生長過程中發揮著重要作用——將碳源轉化為細胞生物量。任何將碳通量從細胞生長轉移到感興趣的產物的嘗試都會干擾天然代謝，并可能影響碳效率。

理論上，阻斷TCA循環及其旁路可以減少碳耗散，促進好氧發酵中的化學生物合成。但三羧酸循環的阻斷往往會干擾細菌的自然生長。

生物轉化罐。陶勇攝

近日，陶勇團隊在有氧發酵條件下的減碳底盤研究中取得重要進展，設計重構一種全新的具有不完整三羧酸循環（TCA）的大腸桿菌底盤細胞，使有氧發酵的碳損失降到最低，從而達到微生物發酵減碳的目標，相關論文發表于《自然—通訊》。

“有了這個底盤細胞，所有α酮戊二酸依賴型的酶催化反應都可以得到優化。可以說是‘一石多鳥’。”論文共同通訊作者、中國科學院微生物研究所研究員陶勇說。 

一個具有挑戰性的決定

三羧酸循環是需氧生物體內普遍存在的代謝途徑，它將有機物質分解為二氧化碳和水，同時產生了大量的高能分子，是糖類、脂類和氨基酸的最終代謝通路。

論文共同通訊作者、中國科學院微生物研究所項目研究員林白雪告訴《中國科學報》：“三羧酸循環是好氧生物生命所必需的循環。我們在這項研究中打斷了三羧酸循環，這是一個很有挑戰的事情。”

這起源于10年前生產實踐中的一個難題。2013年，青霉素由于易造成過敏而漸漸淡出患者的選擇范圍。但我國青霉素產能猶在。

一向關注產業的陶勇團隊注意到，青霉素的替代品、不易引起過敏的頭孢菌素實際上和青霉素結構相差不大。如果能將青霉素轉換為頭孢菌素，一方面能夠解決青霉素滯銷的問題；另一方面也能用生物合成取代原本生產工藝中的化學反應，減少重金屬污染。

“有一種酶可以將青霉素轉換為頭孢菌素的母核，這個酶天然的作用對象是青霉素N，而我們生產的則是青霉素G。”陶勇介紹說，“當時中國科學院微生物所研究員楊克遷提高了酶對青霉素G的親和力，但催化能力還是很低。”

團隊研究發現，要提升這個酶的催化能力，共底物α酮戊二酸是另一個必需品。而α酮戊二酸是三羧酸循環的中間代謝產物。但其通過外源添加的工藝成本太高，如何綠色高效地向青霉素到頭孢的催化反應中供應α酮戊二酸成了難題中的難題。

生物發酵罐。陶勇攝

“既然外源行不通，那就試試內源。”陶勇說，α酮戊二酸在青霉素到頭孢的催化反應中會生成琥珀酸，而在三羧酸循環中α酮戊二酸同樣會生成琥珀酸。團隊不禁設想，如果能讓三羧酸循環中的α酮戊二酸在催化反應中轉化為琥珀酸，不就解決了內源供應問題嗎？

基于此，研究人員將三羧酸循環中α酮戊二酸到琥珀酸的通道斷開，把青霉素到頭孢的酶催化反應偶聯到循環之中，這樣既能在細胞正常生長的同時為酶提供必需的供底物，又解決了α酮戊二酸依賴型的一系列酶的催化能力不足問題。

林白雪說：“我們當時只改了這一步，就把酶催化效率提高了11倍。”2015年，該研究成果發表于《美國科學院院刊》（PNAS）。 

適者生存的“聰明”細胞

新的挑戰又出現了。陶勇回憶道，“三羧酸循環斷了之后，細胞只能在實驗室提供的營養豐富的牛肉膏蛋白胨培養基中生長，一旦移到工業生產所用的無機鹽培養基中，細胞就不長了。”

團隊又馬不停蹄地開始工業化路徑的進一步探索。

自然界中有些微生物天生不具有三羧酸循環，但也能在有氧條件下生存。這讓論文第一作者、當時在中國科學院微生物研究所讀博士的周航興奮起來：是否可以通過人為進化讓切斷三羧酸循環的菌調節自身來適應無機鹽環境呢？

周航開始了為期11周的適應性進化實驗。“我們先把沒有完整三羧酸循環的菌放在牛肉膏蛋白胨培養基中生長，看到有菌長起來后就把它整體稀釋十倍，取其十分之一轉接到葡萄糖培養基里。一共做了45輪循環之后發現，沒有完整三羧酸循環的菌也能夠在無機鹽培養基中正常生長了。”隨后，團隊成員開始著手基因組分析。

2017年，陶勇前往美國參加會議。細菌代謝流分析學者、美國特拉華大學教授Maciek R. Antoniewicz對陶勇團隊正在開展的研究頗感興趣，主動提出可以幫助他們利用同位素標記進行定位。根據對碳13代謝流數據分析，陶勇團隊終于發現了不完全三羧酸循環下細胞仍能正常生長的奧秘。

在細胞中央代謝提供的12個分子中，α酮戊二酸、草酰乙酸和丁二酰輔酶是三羧酸循環所必須的。

“通過代謝流分析可以發現，除去人工阻斷循環的地方，還有兩處沒有流量通過，并且正常的三羧酸循環是順時針流動的，進化后的菌中有一步是逆時針流動。”陶勇告訴《中國科學報》，“細胞很聰明，我們不讓它從這邊走，但它要活下去，它只好把另一步反應突變，調轉方向，以此維持琥珀酰輔酶A的產生。”

于是，他們在實驗室里實現了不完整三羧酸循環的細胞在無機鹽培養基中生存。 

實現高價值化學品的生物制造

從設計到進化再到解析，這已經是一個成熟的研究發現。但周航并不滿足于此。

“大腸桿菌和很多好氧微生物一樣，‘吃’進去的葡萄糖在三羧酸循環中會轉化為二氧化碳。”周航說，二氧化碳的排放減少了直接用于產品合成的碳通量，從而對產品產量產生負面影響。因此，阻斷三羧酸循環及其旁路可以減少碳耗散，促進好氧發酵中的化學生物合成。這也是科學家一直想要提高的有氧發酵中的生產效率問題。

有沒有辦法讓細胞不需要琥珀酰輔酶A，在工業化生產中提高生產效率？周航又一次鉆進文獻里尋找頭緒。

終于，他們發現，“將外源乙酰輔酶A依賴途徑引入到大腸桿菌中，使大腸桿菌不需要依賴琥珀酰輔酶A。”林白雪說，改造后的大腸桿菌在三羧酸循環缺失的情況下，在無機鹽中長得非常好。

團隊構建了一種沒有功能性三羧酸循環的大腸桿菌菌株，該菌株可以作為化學物質生物合成的通用底盤。利用這個底盤細胞，他們開始嘗試不同化學品的生物合成，實現了4種不同化學品的生物合成，提高了產物轉化率。

研究團隊進一步以左旋肉堿生物合成為突破口。左旋肉堿是人體內天然存在的一種類氨基酸物質，廣泛應用于食品添加劑、飼料添加劑、藥物治療等多個領域，具有日益旺盛的市場需求。預計2025年左旋肉堿的市場規模將達到2.5億美元。

陶勇團隊利用上述工業底盤細胞構建微生物細胞工廠，實現了左旋肉堿的綠色高效生物制造。項目獲得具有自主知識產權的關鍵技術，技術達國際先進水平，并已完成技術轉讓，實現產業化，生產后經濟效益可觀。“左旋肉堿項目轉化的實現，說明這個底盤細胞可以‘一石多鳥’，實現了研發的閉環。”林白雪說。

陶勇說，這項研究成果不僅打破了從實驗室到產業化的關鍵瓶頸，更為微生物發酵減碳提供了新的思路。未來，這座綠色高效的“細胞工廠”將會陸續賦能多種化學品合成。陶勇說：“在減少二氧化碳排放的同時，提高合成產物得率，我想這應該是我們做綠色生物制造最理想的目標，也是我們一直在努力的方向。”

相關論文信息：https://doi.org/10.1038/s41467-024-46655-4