酶聯免疫斑點實驗(ELIspot)

實驗材料 血液樣品細胞樣品

試劑、試劑盒 70％乙醇PBS脫脂奶粉鏈霉親和素檢測抗體包被抗體

儀器、耗材 PVDF膜96孔培養板硝基纖維素底板免疫斑點板酶標板

實驗步驟

一、包被96孔板

用70％乙醇浸潤96孔板中的PVDF膜30 s

加入捕獲抗體（PBS稀釋），4℃過夜

倒空板中包被液，輕輕在紙上拍干，用PBS洗滌，禁用洗板機

加入100ul 2%的脫脂奶粉（或者BSA）室溫孵育2小時，封閉板中空白位點

PBS洗滌1次。（如果暫時不用，可將96孔板干燥后4保存，可保存2周以上）

二、細胞刺激和細胞因子捕獲

從新鮮血液中用Ficoll分離PBMC并進行計后，將細胞用培養液稀釋后加入96孔板中。細胞數量需要優化，最好進行備比稀釋以確定合適的細胞數量。通常所用細胞數量為1-2×105/孔。

將96孔板在37℃ CO2孵箱中孵育過夜。禁止移動或晃動板子。

用含0.1% Tween 20 的PBS孵育10分鐘，去除細胞和未結合的細胞因子。然后用含0.1% Tween 20 的PBS洗滌3次。 禁用洗板機。

三、加入檢測抗體檢測

加入標記的檢測抗體（用含1％BSA的PBS稀釋），室溫孵育1-2小時。

加入底物顯色（如果檢測抗體為酶標）或者熒光直接檢測（如果檢測抗體是熒光標記）：在加入底物之前用蒸餾水洗滌板子膜的兩側，以防止部分溶液漏出后導致的背景。監測斑點的形成，適時終止反應。

用蒸餾水洗滌終止反應。

四、結果分析

將96孔板干燥。（將板子放在4℃避光過夜，可使斑點邊緣銳化，更易分辨）

使用讀板儀進行結果分析

ELISpot實驗需要的試劑：

PVDF包被的96孔板 包被抗體 標記的檢測抗體（酶、Biotin、熒光） AP/HRP－鏈霉親和素（如果檢測抗體是Biotin標記） 底物溶液 各種緩沖液：包被液、稀釋液、洗滌液等 陽性對照：重組的細胞因子或者已知產生細胞因子的細胞 96孔板- 硝基纖維素底板、

收起 

其他

一、PVDF-底的免疫斑點板或者平底的酶標板 ELISpot技術要點 

1.  操作BCIP/NBT顯色液時最好戴上手套。

2.  為了防止邊緣影響，最好在96孔扳外面包裹錫箔膜，包裹直到顯色結束再棄去。

3.  加樣細胞和試劑時加樣槍頭千萬不能碰觸孔底的PVDF膜，以防止損壞PVDF膜。

4.  常用的96孔扳雖然不是無菌的，但是短暫的孵育時間和培養液中抗生素的存在，ELISpot的操作過程不會有污染的麻煩。

5.  絕大部分板子只能一次做完，請務必在實驗開始之前設計好實驗方案，盡量最大程度地利用板孔和試劑。

6.  檢測抗體和酶最好現配現用。

7.  為保證結果的準確性，建議作雙復孔或三復孔。

8. 實驗結束后，不要在高于37℃的溫度下干燥，否則PVDF膜可能會破裂。

9. 推薦以下對照設定：

（1）陽性對照：重組細胞因子或確定能分泌該種細胞因子的細胞 陰性對照：相同數量的未刺激細胞 背景對照：無菌細胞培養液 檢測抗體對照：用PBS代替檢測抗體

二、ELISpot技術介紹

從單細胞水平觀察分泌蛋白的表達已成為目前研究細胞功能的重要內容，酶聯免疫斑點法(ELISpot)技術巧妙地運用了酶聯免疫吸附技術，從方法上解決了該難題，已廣泛運用于各項重要課題研究中。ELISpot最初用于檢測分泌抗原特異性抗體的個體B細胞，以后該方法不斷改進，用于檢測分泌特定抗原的單個細胞。

相比較于流式細胞儀、免疫組化、原位雜交等其它在單細胞水平檢測蛋白分泌能力的方法，ELISpot方法更為簡單和穩定，同時具有更高的靈敏度。 ELISpot方法操作簡便，但卻能提供非常類似于體內實驗的環境。在單細胞水平進行特定抗原的監控，可以模擬體內環境，跟蹤細胞因子的產生，是檢測細胞功能的獨特手段。現已被廣泛運用于世界各大實驗室的疾病診斷和科學研究活動之中。

自1983年以來，ELISpot方法得到越來越廣泛的應用，主要包括以下幾個方面：

B細胞雜交瘤的篩選、 化合物和藥物免疫學反應的篩選、 優化樹突細胞和T細胞的抗腫瘤活性、 靶向疫苗的質控、 自身免疫疾病的診斷和預后分析、 自身免疫疾病的免疫治療的監控、 過敏性疾病的脫敏治療的監測、 器官移植中排斥反應的預測 、干細胞功能分析、 基因治療中轉染效率的檢測、組織、腫瘤和免疫細胞低頻分泌譜的分析等等。