通過PCR方法對微量DNA進行定量分析實驗

DNA

蛋白酶消化緩沖液 20 mg ml蛋白酶K (儲于-20℃) 用 50 mmol L Tris . Cl  10 mmol L EDTA pH 7.4 緩沖的酚（儲于室溫） 24 ：1（V V)氯仿 異戊醇 10 mol L乙酸按 冰冷的100%乙醇 70%乙醇 TE緩沖液 pH 7.5 反應混合體系 礦物油 0.8 U μL Taq DNA 聚合酶 用于雜交的寡核苷酸引物

經高壓滅菌的螺口微量離心管 微量毛細吸管或帶一次性可棄吸頭和塞子的正壓移液器或使用帶濾芯吸頭的微量移液器

1) 將細胞或組織樣品，放人螺口的微量離心管中，每2X1O⁶細胞加人100μL蛋白酶消化緩沖液，并加人20 mg/ml蛋白酶K至終濃度為100μg/ml,將樣品放置于50℃過夜。

通常需要設置幾個不含病毒序列的樣品作為陰性對照，要注意避免其他無關DNA序列污染細胞或組織樣本。最好是按目的序列可能性遞增的次序處理樣品。抽提應在遠離處理PCR產物和其他大量DNA質粒的地方進行。操作時戴一次性手套，并且頻繁更換。

2) 使用200μL微量毛細吸管輕輕上下吹吸以混勻樣品。加人100μL緩沖液平衡酚，輕輕混勻；加人100μL氯仿/異戊醇（24 : 1),輕輕混合；高速離心5 min,將水相 (含有DNA)轉移人另外一個新的離心管中。

螺口微量離心管和微量毛細吸管頭可以減少來自微量離心機和自動移液器造成的浮質污染。每種試劑需用一根吸管。盡管帶一次性可棄吸頭和塞子的正壓移液器較昂貴，但比微量毛細吸管更容 易使用。應避免使用曾用于PCR產物或大量質粒DNA離心的離心機。

3) 再一次用蛋白酶消化緩沖液抽提有機相（約為原體積的1/2)，室溫高速離心5min，水相轉移合并到步驟2所得到的水相中。

4) 用等體積的氯仿/異戊醇（24：1)抽提水相2次，每次室溫高速離心5 min,以分離水相和有機相。

5) 最終得到的水相加入10 mol/L乙酸銨，終濃度為2.5 mol/L,再加人2.5倍體積預冷的無水乙醇，輕輕混勻。干冰上放置30 min。4℃高速離心15 min。將沉淀用 70%乙醇洗1次，離心，干燥。

6) 將沉淀用pH7.5的TE重懸（約2 X 1O⁶細胞的DNA提取物溶于100 中，5? 100 ng DNA/μL)。儲于 4℃。

7) 取小份溶液和標準DNA同時在瓊脂糖凝膠電泳，或以溴化乙錠打點定量的方法估計DNA的含量。

8) 準備幾個小管加人來源于非感染細胞或組織的DNA, 1管加人110 ng DNA, I管加 人90 ng DNA,其余的加人100 ng DNA。利用這些小管按以下方法對目的序列進 行一系列10倍稀釋：將已知量（如20 000個分子）的含有目的序列的DNA加人 1lO ng小管中，然后混合。取1/10到另一 100 ng小管中混合，再取1/10到另一 100 ng小管中，如此重復直至小管中含目的序列的DNA<10分子，再從此管中取 1/10加人到90 ng DNA小管中，每管體積應<71μL。

9) 對于每一個擴增反應，分別準備含有24 μL反應混合液的螺口微量離心管，并加人 足量的無菌水，終體積為100μL (加人DNA和Taq DNA聚合酶以后，步驟10和12)混勻后每管覆蓋100μL礦物油，確保反應混合物的表面被完全覆蓋。

10) 只打開那些將包含相同樣品的管子，每個相應的管子中加人100 ng樣品DNA，然后蓋上蓋子，稍加離心使其混勻。加好其他陰性對照之后，應該從無病毒的對照開始，然后按含有目的序列的可能性遞增的次序加入樣品DNA,最后加連續稀釋管。

11) 在水浴或自動熱循環儀上，于94℃變性10 min。

12) 打開管子（包含相同樣品），并且加人5μL 0. 8 U/μL的Taq DNA聚合酶。蓋緊蓋子，重復步驟10?12，處理下一套同樣的樣品。

13) 管子稍加離心一下，55℃ 2 min (復性），72℃ 3 min (延伸）。按以下參數進行PCR反應。

29個循環: 1 min 94℃ (變性)

1 min 55℃ (復性)

1 min 72℃ (延伸)

1個循環： 7 min 72℃ (延伸) 最后儲存于4℃

15) 取小份反應物（1/10反應體積）在合適的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，應包括能夠在溴化乙錠染色和放射自顯影時均能顯跡的DNA標準分子質量泳道。凝膠進行染色和拍照。凝膠用溴化乙錠染色后，對應于來自宿主染色體特定DNA的PCR產物的DNA片段應該很容易看見，并可估算每個擴增反應的效率。如果看到其他的帶，特別是大分子質量帶，也不要感到奇怪，那是一些非特異性PCR產物。

16) 將凝膠上的DNA轉移至硝酸纖維素膜或尼龍膜，如果需要，可通過紫外交聯將DNA固定到膜上。預雜交并用末端標記的、對目的序列特異的寡核苷酸探針進行雜交，通過放射自顯影或Phosphorimagei成像分析。

如果每個擴增反應的效率類似的話，那么預期的結果應該是在重構的系列稀釋樣品中，合適大小的標記條帶的強度也應隨之減弱，在陰性對照中應該沒有同樣大小的條帶，實驗組樣品的條帶強 度也會有所變化。取決于探針和雜交的嚴緊性及洗膜條件，也許會看到探針對大量內部對照產物的非特異性吸附。通常也能看到一些少量的比主要的特異PCR產物遷移率稍大或稍小的PCR產物，特別是在高拷貝的情況下。

假設每個擴增反應的效率是類似的，那么可以通過與系列稀釋的樣品的比較來估計每個樣品中目的序列的分子數。

17) 進一步的定量分析，可以通過在沸水中加熱15 min的方法，將用過的探針從膜上剝離下來，并用針對宿主的單拷貝序列的特異性探針進行雜交。通過密度掃描進行信號定量（按照密度計制造商的使用說明進行操作）并從一系列稀釋度中計算標準曲線，校正宿主序列的信號。通過與標準曲線的比較確定實驗組樣品中的分子數。

理想的標準曲線應該是放射自顯影的信號強度的對數DNA量的對數成線性關系。然而完全的線性關系也許不必要，也不可能斜率就是1。在標準曲線的髙端（每個細胞相當于0.1?1個拷貝），它可能是一平臺。如果這會引起定量困難，就必須減少擴增循環數或改變其他參數。