逆轉錄PCR的原理及操作注意事項

逆轉錄PCR （ RT-PCR ）的原理

逆轉錄PCR (RT-PCR )具有較高的靈敏性、操作簡單等優點，常用于基因定量分析、生物學檢測等，此外常用逆轉錄PCR克隆目的基因。 本文主要講述了逆轉錄PCR的原理、重要參數以及操作注意事項。

cDNA的合成是RT-PCR 的重要環節。以mRNA為模板，在逆轉錄酶的催化下，隨機引物、oligo(dT)或基因特異性引物的引導下合成互補的DNA(complementary DNA，cDNA)，再按照普通PCR的方法用兩條引物以cDNA為模板，則可擴增出不含內含子的可編碼完整基因的序列。

逆轉錄PCR 重要參數

不同mRNA拷貝成cDNA的效率不同;因此，適合于一種mRNA拷貝的條件可能對另一種mRNA不適合。一般來說，從事不均一mRMA群體時，所使用的條件是導致cDNA合成的終產量達到最大，下述參數十分重要。

1.逆轉錄酶 有兩種不同的逆轉錄酶可以催化以mRNA為模板，oligo(dT)作為引物，合成與mRNA互補的cDNA鏈。一種來自純化的禽成髓細胞瘤病毒(AMV)，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的RNA酶H活性，它最適溫度是42℃，最適pH8.3。在高反應溫度時可消除mRNA的二級結構對逆轉錄的阻礙，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA產生也限制其長度。另外，禽源逆轉錄酶制劑可被能切割DNA的核酸內切酶污染。

另一種來源于鼠白血病病毒(Mo-MLV)，是單肽鏈的，有RNA聚合酶活性和相對較弱的RNA酶H活性，最適溫度37℃，最適pH7.6，較弱的RNA酶H活性對獲得2-3kb的mRNA的全長cDNA有很大好處。

在第一鏈反應前可用氫氧化甲基汞處理，破壞mRNA的二級結構，這一步對于最適反應溫度較低(37)℃的鼠源逆轉錄酶催化的反應可能更為重要。臨合成cDNA第一鏈之前加入過量的巰基試劑，可以使氫氧化甲基汞從RNA上解離。

2.單價陽離子 離子條件基本上影響各種模板的轉錄效率。用鉀比用鈉離子可獲得較長的轉錄產物。對于cDNA長度的最適鉀離子濃度為140-150mM。

3.二價陽離子 對于反轉錄酶活性來說，二價陽離子是必需的。低于4mM Mg2 未能觀察到活性;產生全長轉錄產物的最適濃度是6-10mM。

4.脫氧核苷三磷酸 使用四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)中每一種的高濃度對于有效合成cDNA是特別重要的。如果其中只有一種的濃度下降到10-50微摩爾以下，全長轉錄物的產量將明顯下降。常用的dNTP的濃度為200-250微摩爾。

材料與方法

1 材料

RNA樣品

2 儀器、用具

PCR儀、電泳儀等、0.2mlPCR管(1個)、移液器、碎冰

3 試劑

RNase Free dH2O;5×RT Buffer (含25mM Mg2 );dNTP (10mM each);RNase Inhibitor(10U/μl );Oligo (dT)20 (10μmol/L);ReverTra Ace

4 方法

(1) 以總RNA為模板，合成cDNA第一鏈，體系如下：

(2) 反轉錄反應條件為：30℃ 10min，42℃ 30min ，99℃ 5min，4℃ 5min。反應結束后冰

浴5min。

注意事項：

① cDNA第一鏈合成的反應液冰上配制。

使用ReverTra Ace、RNase Inhibitor 等酶類時，應輕輕混勻，避免起泡;由于酶保存液

中含有50%的甘油，粘度高，分取時應慢慢吸取。

逆轉錄PCR時，提取RNA是關鍵，收集RNA沉淀時，離心速度不要低于13000rpm，在離心前的沉淀也盡可能在低溫下條件下操作，此外逆轉錄酶可以選擇MMLV逆轉錄酶，主要是因為這個條件比較容易掌握