質譜定量的簡介和LC／MS監測的模式

簡介

使用質譜作小分子藥代動力學分析，即PK/MS。除此之外，這些同樣的原則也可用于生物基質中肽和蛋白的定量。

傳統上，在使用現代質譜定量之前，定量是用HPLC高效液相色譜和UV紫外檢測器實現的。HPLC 藥代動力學分析建立在保留時間、峰面積和紫外光譜性質的基礎上的。HPLC方法的缺點是靈敏度不夠、缺乏特異性。我們已經看到一些實例，一個化合物的確已經代謝了，然而保留時間和紫外光譜上，母離子和代謝物無法區分。這種缺少特異性的分析時不時會誤導研究者。所以在藥代動力學分析中，基于質譜的表征現在是一種新型的重要的工具。

質譜定量中已經被廣泛接受的方式是MS/MS定量。這種定量常通過三級四極桿或離子阱質譜實現。要求使用MS/MS的原因是：許多化合物有同樣的質量。當使用第一個維度即單級質譜MS去定量時，也會缺乏特異性，尤其是對于像血液那樣的復雜的基質。第二個維度的MS（即MS/MS）在大多數情況下，能夠提供唯一的斷裂。合并特異的母離子質量和唯一的碎片離子信息，可以選擇性地監測被定量的化合物。下面我們將討論獲得和可視化LC/MS數據的方法。

獲得和可視化LC/MS的數據，或稱為：質譜數據如何在一個LC/MS實驗中表達？

典型的方法，質譜被設置為掃描特定的質量范圍。在全掃描分析中，質量掃描范圍較寬；在選擇離子監測SIM時，質量掃描范圍較窄。依賴于掃描的類型，一個獨立的質量掃描時間可以從10 ms到5秒。在一次LC/MS分析中可獲得許多個掃描。LC/MS數據的表示方法為：把每個質量掃描的離子流信息疊加，畫出隨時間變化的總離子流，橫軸是時間，縱軸是強度。總離子流圖非常像HPLC的紫外圖，見圖1。

圖1

下面我們將討論各種掃描的模式，和這些模式同質譜定量的關系。

最常見的LC/MS數據模式為：

（1）   總離子流圖

（2）   選擇離子監測（SIM）

（3）   選擇反應監測（SRM）或多反應監測（MRM）：MRM和SRM本質上是同樣的實驗模式。

全掃描分析

從藥代分析中得到的全質量范圍的總離子流圖（TIC）非常像HPLC UV圖，除了：質譜能檢測到更多的化合物，尤其是沒有紫外吸收的化合物。總離子流是一個疊加圖，疊加了每個質量掃描的離子流。當一個小分子或小肽流出HPLC色譜柱時，相對強度上升，在TIC圖上出現了一個峰，橫軸是時間。每個質量的化合物都被記錄在TIC圖上。找出感興趣的化合物可能是困難的，因為許多化合物有相同的質量。化合物的天然質量不是鑒定的唯一性數據。設置一個確定的質量，可以畫出一個提取離子流圖，但這個圖的強度會比下面介紹的SIM實驗中的強度低。

（注意：TIC指的是在一段時間內采集的質量掃描數據，不特指掃描范圍或質譜實驗的類型。例如，我們可以在SIM或SRM實驗中獲得TIC圖。然而，為簡單起見，我們將把這些圖稱為SIM和SRM圖，而不是SIM TIC圖。）

Selected Ion Monitoring選擇離子監測

在選擇離子監測中，質譜被設置為掃描一個非常小的質量范圍，典型的是一個質量數的寬度。選擇的質量寬度越窄，SIM的確定度越高。SIM圖就是從非常窄的質量范圍中得到的離子流圖。只有被該質量范圍選擇的化合物才會被畫在SIM圖中。圖1和圖2是同一個樣品的譜圖，然而它們看起來很不相同。原因是在SIM圖中，畫的是TIC圖中較少的組分。SIM圖是比TIC圖更確定的圖。

圖2

然而，SIM圖仍顯示了許多峰，不能唯一地確認我們感興趣的化合物。一個復雜的樣品（比如血清或血漿）中，這樣的圖是一個典型的SIM圖。許多化合物有同樣的質量，在ESI中還有多電荷峰也和我們感興趣的化合物有同樣的m/z值。SIM實驗比全掃描實驗更靈敏，因為質譜在一個更小的質量范圍上駐留（dwell）更長的時間。

Selected Reaction Monitoring選擇反應監測 （SRM）

SRM被大多數科學家在質譜定量中使用，見圖3。SRM中，可以監測一個特征的唯一的碎片離子，在很多非常復雜的基質中進行定量。SRM圖非常簡單，通常只包含一個峰。這種特征性使SRM圖成為靈敏度高且特異性強的理想的定量工具。

圖3

SRM的過程：選擇一個特征的母離子做MS/MS，在其碎片中選擇一個特征的子離子作為監測離子。可以把SRM理解為碎片離子的SIM。這種特征性的實驗被成為“transition”（躍遷），可以表示為：母離子 → 子離子，舉例：534 → 375。