質粒抽提的原理及操作步驟

質粒抽提方法即去除 RNA，將質粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。今天我們主要來了解一下質粒抽提原理和操作步驟。

⒈質粒抽提原理

其中用到三種溶液以及硅酸纖維膜（超濾柱）。 溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA，pH 8.0；溶液Ⅱ：0.2 N NaOH / 1%SDS； 溶液Ⅲ：3 M 醋酸鉀/ 2 M 醋酸/75%酒精。

溶液Ⅰ

葡萄糖是使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，其主要目的是為了螯合二價金屬離子從而達到抑制DNase的活性；可添加RNase A消化RNA。

溶液Ⅱ

此步為堿處理。其中NaOH主要是為了溶解細胞，釋放DNA，因為在強堿性的情況下，細胞膜發生了從雙層膜結構向微囊結構的變化。SDS與NaOH聯用，其目的是為了增強NaOH的強堿性，同時SDS作為陰離子表面活性劑破壞脂雙層膜。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷也會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA會斷裂。

溶液Ⅲ

溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反應。其中醋酸鉀是為了使鉀離子置換SDS中的鈉離子而形成了PDS，因為十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同時一個SDS分子平均結合兩個氨基酸，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質沉淀了。2 M的醋酸是為了中和NaOH。基因組DNA一旦發生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDS共沉淀了，所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。75%酒精主要是為了清洗鹽份和抑制Dnase；同時溶液III的強酸性也是為了使DNA更好地結合在硅酸纖維膜上

⒉質粒抽提步驟

⑴使用質粒提取試劑盒提取質粒時請參考具體試劑盒的操作說明。如Omega公司的E.Z.N.A.? Plasmid Mini Kit I, Q(capless) Spin （質粒提取盒）。

⑵堿裂解手提法：此方法適用于小量質粒DNA的提取，提取的質粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：

①接1%含質粒的大腸桿菌細胞于2mlLB培養基。

②37℃振蕩培養過夜。

③取1.5ml菌體于Ep管(離心管)，以4000rpm離心3min，棄上清液。

④加0.lml溶液I（1%葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0）充分混合。

⑤加入0.2ml溶液II（0.2mM/LNaOH，1%SDS），輕輕翻轉混勻，置于冰浴5min.

⑥加入0.15m1預冷溶液III（5mol/LKAc，pH4.8），輕輕翻轉混勻，置于冰浴5min.

⑦以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管。

⑧加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10min.

⑨以10，000rpm離心20min，棄上清。

⑩用70%乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。

?待沉淀干燥后，溶于50ulTE緩沖液中（或60℃溫育去離子水）。