1590 年荷蘭人米德爾堡和詹森設計制造了最原始的顯微鏡，1610 年伽利略使用望遠鏡觀察小的物體并將其放大，后來被列文霍克改進成為原始的顯微鏡。1658 年意大利人馬爾皮基應用最原始的顯微鏡首先觀察到了紅細胞，他是第一個見到紅細胞的人，開始進行紅細胞計數則是200 年后的事情了。而設計并生產出第一臺血細胞計數儀則又過了近100 年。
自從發明了顯微鏡以后，人們從微觀世界中了解和觀察到了血液的組成，并根據他們的特點分別將它們稱為紅細胞和白細胞和血小板。在以后的研究中，人們發現許多疾病的發生和發展與血液中的細胞數量之間存在一定的關系。依據對疾病診斷的需求，人們開始尋求對血液中細胞的數量進行計數。1852 年就有人開始設計對紅細胞的計數辦法，1855 年發明了用于計數血細胞的計數板， 目前仍然使用的改良Neubauer 計數板就是應用最為廣泛和持續時間最為長久的經典一種，雖然各種類型的血細胞計數儀已在廣泛使用，但血細胞計數板法仍然是最為可靠和最為經典的計數技術，它不僅適用于血細胞計數， 還可用于其他細胞、動物血細胞、微小粒子及需要在顯微鏡下計數的各種樣品，因此計數板仍然是檢驗工作者應該掌握的基本技能，是不應該忘記和放棄的手段。
隨著對血細胞計數和分析需求的不斷增加，對血細胞計數的方法進行改進，實現自動化、高速度、準確性、標準化和智能化的要求也越來越高，現代的血液細胞分析技術與50 年前的發明雖然有著本質上的相同或相似，但已經有了顯著的飛躍。作者力圖通過有限的資料對細胞計數和分析技術的發展進程進行回顧，并對最新的進展進行介紹和展望，期望對關注這一領域和從事血細胞分析工作的同行有所幫助。
一、血細胞計數儀的發展歷史
談到血細胞計數儀的發展史，在這個領域首開先河的人是1912年出生在美國阿肯色州一個小城的人Wallance H. Coulter，他年青時對電子學非常感興趣，最初是一位廣播電臺的電器工程師，后來做過X光機的銷售員和維修工程師，在亞洲許多國家包括我國的上海工作過。1948 年他在芝加哥一家公司工作時，在一間地下室建立了自己的實驗室，開始秘密的從事自己的實驗，這項實驗導致了一個重大的發明，他發現了微小粒子通過特殊的小孔時可產生電阻變化這一現象，并根 據這種電阻變化特點將其應用于微小粒子的粒度測量和計數上。科技界為表彰他的發明，將其稱為庫爾特原理（Coulter principle ）。根據這個原理，Coulter 先生將其引入到血液細胞計數上，在1953 年獲得美國發明ZL，同年和他的兄弟約瑟夫（Joseph ）開創了自己的公司，并成功的設計和制造出了可以計數血細胞的專用儀器，然后開始了在這一領域的商業運作。這種儀器看起來非常原始和簡單，好象一個示波器另加一些管道、電極和瓶瓶罐罐 。它的計數原理是根據血細胞的不良導電性和產生電阻抗原理來計數血液中的細胞，也就是電阻式血細胞計數原理，這種原理現在已經成為血細胞計數和分析中最為經典的原理。
最初的血細胞計數儀是一種單參數測定儀器，只能對血液中的紅細胞和白細胞進行計數，并且需人工切換。最早生產的血球計數儀為Coulter A型，筆者曾經見到和使用過Coulter D型，那是一個黑色外殼的長方型儀器，它的前面有一些調節輪盤，右下方有一個可以升降的樣品臺，它通過U型水銀管控制計數時間和計數容量，外側安裝有一個窺孔器（用于觀察計數小孔是否有堵塞的放大鏡），通過數碼管顯示結果，通過切換按鍵選擇白細胞還是紅細胞計數的簡單儀器。1958 年以Coulter 命名的專門從事顆粒性測量和計數的儀器公司，庫爾特電子（Coulter Electronics ）公司成立。
此后，歐洲、日本也開始了血液細胞計數儀的開發和研制,我國在60年代中期也開始了這種儀器的開發和生產。例如日本Sysmex 公司1962 年就生產了可進行紅細胞和白細胞計數的CC-1001 型血球計數儀，我國1965年在上海也生產了簡單的血細胞計數儀，1975 年北京醫療儀器廠也開始模仿設計自己的簡單的紅白細胞計數儀。到目前為止已經有許多國家開始生產各種類型的血細胞分析儀，經過半個多世紀的發展，這種儀器已經有了非常明顯的進步。以前因為只能進行細胞計數，因此我們一般將這類儀器叫做血細胞計數儀（Blood Cell Counter）,由于技術的進步目前這類儀器可以提供除了血細胞計數以外的更多參數的聯合測定和分析，因此我們一般將這類儀器統稱為血液細胞分析儀(Hematology Analyzer) 。
經過多年的發展，特別是近年來電子計算機技術的發展，血細胞分析儀無論在技術上、形式上、功能上、參數上、用戶界面上等許多方面都有很大的改觀和進步。
因人所共知的原因，我國和美國在50年代基本沒有任何貿易往來，因此英國進口的EEL型血球計數儀應該是國內引進比較早的血球計數儀。協和醫院檢驗科在60 年代初期就引進了這樣一臺儀器，該儀器是具有代表性的早期采用光學的細胞移動型血細胞計數的儀器，也是最早使用光學法和殼流技術的儀器。血細胞在流動的殼液的帶動下經過光軸的中心，在暗視野下呈現出明亮的光脈沖信號，通過對這個信號的收集和分析來計數血細胞。該儀器的特別之處是稀釋倍數和人工計數法一致，當儀器出現故障時，將標本滴入計算板仍可實施人工計數。該儀器體積較大，并缺乏備件，在80年代初期停止了使用，遺憾的是筆者沒有找到該儀器的資料照片。
二、血細胞分析儀發展中的技術進步
隨著各種技術的不斷進步以及實驗室工作對儀器設備需求的不斷增加， 血細胞分析儀的各項用途和用法也有不斷的進展，這首先體現在儀器應用的方便性、準確性和盡可能增加的參數上。
1、稀釋技術的進步： 早期的儀器一般要求在測定前先進行人工稀釋，因此許多操作要求直接取20～40ul 的末梢血加到稀釋液中。白細胞稀釋比例多在1:251 和1:501倍，紅細胞則需要進行二次稀釋， 稀釋倍數在6.25～25萬倍之間， 然后再將稀釋好的標本放入計數杯內進行計數，而且需要在白細胞稀釋懸液中加入溶血劑。由于人工稀釋費時費力且精確性差，隨后的一些血細胞計數儀增加配置了專用的稀釋器， 專供該型號的儀器進行機外稀釋，這樣減少了人工稀釋帶來的誤差和麻煩，提高了效率。這類儀器的典型例子有國內應用非常普遍的SysmexF820 型， 此型號儀器到目前仍有市場需求并在廣泛使用。現代的血細胞分析儀則更加先進，已經將自動稀釋技術，自動進樣方式全部添加到儀器本體內，即提高了技術含量、取樣和稀釋的精確度，使得進樣的速度和可操作性更加方便，同時使得檢測速度加快。
2、分析參數的增加：前面談到早期的血球計數儀僅能進行紅白細胞計數， 而且是需要通過切換分別進行紅白細胞得計數， 所以將其稱為血細胞計數器是恰當得。由于血常規檢驗對血紅蛋白測定的需求增加，沙利比色法由于精度和操作不便不能滿足臨床需求，已經有單獨的血紅蛋白比色計配備，將加入專用的溶血劑后的樣本進行白細胞計數后再將其倒入血紅蛋白比色計， 即可得到比色法測定的血紅蛋白結果。此時期國內使用最多的血細胞計數儀是Coulter ZF 型和血紅蛋白計。由于對血紅蛋白測定要求的增加，因此在儀器內增加一套比色裝置，就可方便的測定血紅蛋白。電阻法定細胞數量的同時還可對細胞體積進行測定，因此對紅細胞平均體積（MCV）、紅細胞壓積（HCT）、平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）測定和計算也成為血球計數儀的標準參數。1975 年日本東亞公司（TOA， Sysmex 的前身） 推出了包含以上7 個參數的全自動血細胞計數儀器CC－710 和CC －720 型。
3、血小板計數功能的增加：血小板是血細胞中最小的粒子，早期的血細胞計數儀均不包含血小板計數。60 年代起國外開始研制血小板計數儀，70 年已經有比較成熟的產品，這類儀器一般需使用PRP 血漿進行， 即使用特殊的離心速度將紅細胞和白細胞進行沉淀，使上層血漿中盡量保存最為豐富的血小板，然后應用這種PRP 血漿進行血小板計數，例如Sysmex PA-701 型和CONTRAVE 1000 型，此類儀器多配有專用PRP 離心機。使用全血方式和水動力聚集方式計數血小板的儀器如Clay-Adams 的Ultra-Flo100 型以及80 年代后出現在我國的Baker S-810 型血小板分析儀，該儀器設定了單獨血小板分析測量通道，根據紅細胞和血小板體積的顯著差異他們區分開，將血小板按體積大小劃分到64 個通道，分別累加體積大小不同的血小板數量。它通過直接吸入稀釋好的血細胞懸液進行測定，除了給出血小板數量外，還提供了兩個新的參數，平均血小板體積(MPV) 和血小板體積分布寬度（PDW）。在這之后血細胞分析儀將血小板計數這一重要功能合并到全血細胞計數（CBC） 范圍內。當時的儀器有很多型號，例如Baker 8000, Sysmex CC-800,Coulter S 系列和T 系列等。
4、定量部的改進：儀器為了準確進行細胞計數，除了要準確稀釋血液外， 對直接進入計數小孔內的液體量也要進行定量控制，因此儀器對定量部的要求是非常嚴格的。在血細胞計數儀開始階段， 人們設計了U型水銀管壓力計，通過水銀的重量和在兩個電極間的距離來控制吸入的標本量。后來人們通過兩只光電管來了解液體通過一個固定距離所需要的時間和容積來控制標本的吸入量，還有一些公司設計并使用了微量注射器技術以及浮球定量技術來控制計數樣本的量。最新的光電計時容量控制技術控制標本進入計數區的量，可以使得進入計數區域的細胞懸液定量更加準確和無污染、同時還可判斷小孔是否出現堵塞或半堵塞問題，以及便于維護。
5、自動取樣技術： 由于儀器需要對全血進行自動取樣和稀釋， 因此取樣量也同樣需要精確控制。最初的儀器是需要進行手工取樣和稀釋的，后來逐漸有了外置式專用取樣稀釋器。再后來儀器內部設置了內置式負壓取樣稀釋器，根據負壓量的大小來吸取血液樣品，這對控制負壓的精確度要求很高，此外還有微量注射器取樣技術，依靠光電管控制血液取樣量的技術等。目前認為采用旋轉閥取樣技術是比較精確的方法，旋轉伐內部有多個按一定體積設計的小孔，當血液進而后，旋轉伐從吸入的小孔轉向排出的小孔，此時血液不能再進入，而孔內保留的固定量的血液進入儀器的稀釋部，然后清洗，再進入下一次循環。目前許多更加先進的血液分析儀均采用陶瓷制的旋轉閥來分配血液標本。
進樣方式也從最初的單一預稀釋方式，演化為預稀釋和全血方式兩者兼有。現在許多先進的五分類血液分析儀還采用了更多種進樣方式，例如Sysmex XE-2100 和Bayer Advia 120 型，如末梢血方式、開蓋手工進樣、閉蓋手工進樣、急診檢驗進樣、全自動進樣等方式以及連接到全自動流水線的自動進樣技術等。進樣設備有的采用旋轉式進樣盤，如MEDONIC CA570和SWELAB AC920/970, 這種旋轉式進樣器多是選配件。更多的血液分析儀采用了平推式的自動進樣系統，即將待檢樣品插在專用試管架上，儀器將試管架一步步送入儀器的取樣口，測定完畢后自動推出。平推式自動進樣系統在有些廠家的儀器上是可選擇的配件，而在某些儀器上則是必備件。
5、儀器的清洗技術：最初的儀器的清洗靠人工浸泡或使用毛涮清洗，如果測定完一個很高值的標本，則需要用空白液清洗一下，以防止對下一個標本的攜帶污染。而現在許多儀器在完成一個標本的檢測后可自動對計數小孔、管道進行沖洗，還可同時對取樣器、稀釋器、取樣針內外進行全面清洗，減少交叉污染的機會。許多儀器在開機和關機時可自動執行清洗程序或按事先設定的清洗程序進行定時清洗，保證儀器正常工作。
6、小孔管技術的改進：小孔管是血細胞分析儀進行計數的關鍵部件，早期的儀器一般僅有一個直徑為100μ的小孔管，多使用寶石經過激光精確打孔，然后鑲嵌再玻璃支撐物上。現在多數電阻法儀器的小孔管在白細胞檢測上使用直徑為100 μ的小孔管，在紅細胞和血小板檢測上使用直徑為60～ 80μ的小孔管，材料有寶石和特殊陶瓷等構成。例如經典的COULTER 外置式小孔管，當發生堵孔時可用毛刷清理或直接拆下來清洗。早期的小孔管一般暴露在外邊，其主要目的是便于人工清洗，多為單管方式，進行白細胞到紅細胞計數轉換時最好清洗一下。后來發展為紅細胞和白細胞各自獨立的兩個暴露在外的小孔管，一般20秒即可同時完成紅細胞和白細胞的計數，需人工使用加樣器或定量吸管從白細胞稀釋懸液中進行紅細胞的二次稀釋或使用配套的稀釋器。目前的儀器小孔一般采用內置式，減少了污染的機會并同時提供了自動清洗功能，使得每次計數后都能提供自動沖洗，減少了交叉污染的機會同時計數的速度也有了很大提高。
為了更加準確的對細胞計數和防止各種干擾發生，各公司在小孔管的改進和設計上使用了不同的處理方案。這些技術有力的保證細胞計數準確，特別是血小板計數的準確性。
（1）掃流技術（Sweep Flow）： 為減少已通過計數小孔后由于液流的回流而重新返回計數區造成重復計數，在小孔后面增加一個掃流液系統，將計數過的細胞通過掃流液沖進廢液管道。
（2）防反流裝置（Von Behrens）： 為防止細胞返回到計數敏感區，在小孔后面加一個帶孔的當板，用負壓將已經計數過的細胞阻擋后直接收集到廢液管道中。
（3）水動力聚焦技術（Hydrodinamic Focusing）： 是目前認為最為有效的方法，也叫鞘流技術。它利用流體動力學原理，即可保證細胞位于鞘液中心并排成一列通過檢測孔中心或通過激光束中心，又保證它不會返回敏感區，目前許多較為高級的血液分析儀一般采用此種技術。
7、其他用于保證計數精確性的技術：
（1） 脈沖編輯功能（Pulse Edit）： 可防止因細胞未從小孔中心通過而產生的脈沖改變并對其進行技術性修正，以得到準確細胞計數和體積測定結果。
（2） 三次計數技術或多段計數技術（Voting）：采用同時進行三次計數取平均值的做法或將總體計數時間分為多段進行統計，如果各段之間差異不大，可直接給出準確結果，如果差異稍大則進行提示或報警，如果差異明顯則不給出結果，因而保證了計數結果的質量和準確。
（3） 重疊校正技術（Coincidence Correction）：通過儀器的邏輯電路和數學計算以及按照計算公式將重疊校正公式編入儀器的測定程序中，當出現兩個細胞同時通過小孔的現象時，儀器就會很容易進行判斷、運算處理后將結果校正過來。
（4） 浮動界標技術（Floating Threshold）：為保證血小板計數的準確，浮動界標將根據紅細胞和血小板分布曲線的交界處尋找最低點，將此點作為紅細胞和血小板計數的分界線，這樣可以很好的處理過多小紅細胞對血小板計數的干擾問題。
（5）擬合曲線技術（Fitting Curve）： Coulter公司設計的血小板計數范圍是2~20fl， 為排除噪音干擾和小紅細胞干擾， 根據正常人血小板體積分布呈對數正態分布的理論， 通過電子曲線擬合將沒有被計數的大血小板計算在內，得到既無噪音干擾又無小紅細胞影響的準確血小板計數結果。
（6） 延時計數計數（Extended Count）：當細胞數少于特定值時，儀器自行重復計數，以保證獲取更多的細胞數，以減少統計學誤差得到更加正確的結果和直方圖形。
8．各種故障處理功能的進展： 任何一臺血液分析儀都會有故障，而簡單的故障處理方法和程序將給用戶帶來方便。
（1） 堵孔的處理： 堵孔為最常見原因，在沒有處理程序前， 人們是通過毛刷來清洗小孔的。后來儀器設置了自動排堵功能，通過負壓或正壓，使用清洗劑對小孔的內外進行強力沖洗來排除堵孔。后來發展為燃燒電路，對小孔局部增加高電壓，使得堆積在小孔周圍的蛋白質等雜質變質和灼燒，然后用清洗液沖洗干凈。
（2） 自動報警功能：儀器可在開機或運行期間對儀器本身的溫度、壓力、液流系統、試劑、電子系統、光路系統等各個需要控制的部件進行監控，一但超過標準或出現故障，儀器可以顯示這個故障和記錄這個故障，并在手冊或軟件中增加排除故障的方法介紹。
（3）遠程診斷系統：更加先進的設備可以通過Internet 網絡和儀器生產廠家在網絡上建立聯系，可以將你的故障和問題直接傳送到儀器廠家的技術支持部門，由他們在網上對儀器進行診斷，提供解決方案，甚至工程師可以通過網絡遙控的方式直接排除故障。
（4） 幫助方式：許多儀器設計了很多故障自動診斷和幫助方式。早期的儀器一般是將儀器可能出現的各種故障和解決方法用用戶手冊的方式提供，目前更先進的方法是儀器可自動提供診斷報警，用符號表達或用文字直接表達， 或按幫助鍵（help） 后自動列出并提供解決故障的參考方法。而BAYER ADVIA 120 型血液分析儀更將整個操作說明和故障診斷等各項幫助程序存入系統中，可以方便的使用檢索方式或鏈接方式找到各項目的說明和幫助，甚至提供動畫方式對原理和儀器維護進行演示，提供各種散點圖的模式和介紹。
9、質控程序的進展：血液分析儀需要進行日常質量控制，以監控其測定結果的準確性。早期的血液分析儀一般沒有質控程序，是依靠人工記錄質控數據，人工繪制質控圖。90年代以來由于微機技術的發展，使得包括質控程序在內的許多功能得以在血細胞分析儀上實現。例如浮動均值質控法，自動將符合條件的每20個樣本的MCV 、MCH、 MCHC 數值求出均值并儲存，最后繪制為浮動均值質控圖，如Sebia 的Hemalyser 3 型就有這個功能。近年來的許多儀器都增加了多種質控程序，例如ADVIA 120型血液分析儀和SYSMEX XE-2100 型血液分析儀， 可以將日常質控的多達20組的質控數據儲存在機內，或傳人相連的電腦處理，甚至通過網絡直接發送到廠家的服務器，設備廠商可通過