一、過碘酸鈉氧化糖蛋白樣品
1. 在 0.1 mol/L 醋酸鈉 pH 4.5 緩沖液（50 mmol/L 磷酸鈉，pH 7.4 ) 中制備蛋白溶液，在冰上預冷。
2. 用水制備新鮮的 0.5 mol/L 過碘酸鈉原液，暗處保存，并在冰上預冷。
3. 加足夠新鮮的過碘酸原液至蛋白樣品中使成至 10 mmol/L ( 1 mmol/L )。
4. 在室溫下避光保存 1 小時，或在 4℃ 保存 4~24 小時（冰上 30 分鐘）。
5. 加入 1/10 體積的 0.5 mol/L 1，2-亞乙基二醇終止反應。
6. 用 TCA/DOC 沉淀蛋白，按照 PNGaseF 方案第4步所述進行。
7. 冷丙酮清洗沉淀物兩次。或者通過對 PBS 透析去除 1，2-亞乙基二醇。至此，樣品可以進行生物素化。
二、用生物胞素酰肼生物素化醛基
1. 在 DMSO ( 或 DMF) 中制備生物胞素酰肼的貯備液，冷凍保存。
2. 將過碘酸氧化后獲得的沉淀懸浮于 pH 7.4，100 mmol/L 的磷酸鈉中，并滴定到 pH 7 ( 用 pH 試紙和每 0.5 μl —份的 1 mol/L 的 Na2HPO4）。
3. 加 1/10 體積的生物胞素酰肼原液，在室溫下保溫樣本 1 小時。
4. 按照 PNGaseF 方案中第4步所述的方法用 TCA/DOC 沉淀生物素化樣品，以制備 SDS-PAGE 樣品。
三、用過碘酸生物胞素酰肼檢測固定于膜印跡上的蛋白
1. 在 PBS 中，用 1% BSA 封閉固定有蛋白的 PVDF 膜。
2. 用 PBS 清洗印跡膜三次，用 0.1 mol/L pH 4.5 的醋酸鈉清洗一次。
3. 膜在含 10 mmol/L 過碘酸鈉的 0.1 mol/L pH 4.5，醋酸鈉溶液中，室溫下避光保溫 1 小時。
4. 用 PBS 清洗印膜 3 次。
5. 用含 3 μg/ml 的生物胞素酰肼的 PBS 溶液覆蓋在印膜上，放在室溫下 1 小時。
6. 用 PBS 清洗 3 次，并且用鏈親和素-HRP 進行染色。 展開 | 