蛋白質的短暫表達實驗

載體

牛血清 DMEM 葡聚糖 PBS DMSO EDTA

培養皿 培養箱 相差顯微鏡 離心機

1.  將目的基因亞克隆至合適的載體中得到所需的重組DNA，用小量法（5 ml 培養物）或用CsCl/溴化乙錠離心法純化重組DNA。

2.  將在DMEM-10 CS中生長匯片的COS-7細胞（每100 mm 培養皿約細胞）在轉染的前一天以1：5的比例分瓶，這樣第二天細胞將長至約50%匯片的程度，讓細胞在 CO₂培養箱中于37℃生長過夜至約50%匯片。

3.  使用前（相應于待轉染的每一個100 mm 平皿的COS細胞）將55 ml 37℃的DMEM-10 NS 培養液與5~10 μg 重組DNA徹底混勻，再加入0.2 ml 葡聚糖/氯喹溶液，混勻。

4.  吸出COS細胞的培養液，向每一個100 mm 平血加入步驟3制備的DMEM-10 CS/DEAE-葡聚糖/DNA。在CO₂培養箱中，37℃溫育細胞3~4 h（可能需要優化），用相差顯微鏡觀察細胞。

5.  吸出DMEM/DEAE-葡聚糖/DNA，加入5 ml 10%DMSO（用PBS配制），室溫溫育細胞2 min。吸出DMSO并加入10 ml DMEM-10 CS。讓細胞在培養箱中于37℃ 生長過夜（12~20 h）。

6.  將毎個100 mm 平皿中轉染的COS細胞傳代至兩個新的100 mm 平血。按步驟7a或 7b于37℃溫育細胞。

7a.  當表達分泌蛋白時，在完成步驟6后96 h，加入5 ml DMEM-10CS并培養4天。收獲培養液，室溫下以約1 000 g 離心10 min，除去死細胞和碎片，保留上清液，用代謝標記、免疫沉淀、免疫親和層折、放射免疫、免疫印跡或生物學鑒定來檢測分泌蛋白質。

7b.  當表達細胞表面蛋白或細胞內蛋白時，按步驟5轉染后72 h，從細胞中吸出培養液。加 入5 ml PBS，搖晃洗滌，吸出PBS。加入5 ml 溶于PBS中的0.5 mmol/l EDTA，在COS培養箱中37℃保溫15 min。用巴斯德吸管輕輕移出培養皿中的細胞，采用合適的 熒光抗體使細胞表面蛋白染色，通過顯微鏡或流式細胞儀檢測。