蛋白質的生物合成標記實驗

蛋白質

甲硫氨酸 PBS

培養箱 離心管

1.  培養懸浮細胞至對數增長期，室溫300 g 離心5 min。回收10⁷~10⁸細胞。

2.  每2×10⁷細胞用約10 ml 37℃的短時間標記培養基在圓錐型試管中洗滌，于室溫300 g 離心5 min 回收細胞，小心重懸細胞并重復洗滌過程。

3.  以37℃的短時間標記培養基重懸至5×10⁶細胞/ml，于37℃保溫15 min 以耗盡細胞內的甲硫氮酸，間歇搖動。

4.  室溫解凍［³⁵S］甲硫氨酸，并用37℃短時間標記培養基來配制含0.1~0.2 mCi/ml 的工作液。

5.  室溫300 g 離心5 min，回收細胞，每2×10⁷細胞以4 ml［³⁵S］工作液重懸于圓錐試管。37℃水浴保溫30 min~3 h，頻繁翻覆試管以混懸細胞。

6.  4℃ 300 g 離心回收細胞，小心重懸于10 min 冰冷PBS緩沖液，重復離心操作。

7.  必要時，用TCA沉淀法確定放射性標記的摻入量，按免疫親和層析、免疫沉淀法和單向和雙向凝膠電泳處理和分析細胞。

1.  在標記過程，會釋放揮發性的［³⁵S］化合物，在使用前須把過于37℃水浴的［³⁵S］甲硫氨酸緊緊密封，不要在37℃放置超過30 min。

2.  培養液和冼滌液具放射性，須遵循放射性物質的使用和丟棄的安全守則進行。