蛋白質提取（水溶液提取法和有機溶劑提取法）

蛋白質的提取工作是將經過處理或破碎的細胞，置于一定的條件和溶液中，讓被提取物充分釋放出來的過程。影響提取的因素主要是被提取物質在提取的溶液中溶解度的大小及由固相擴散到液相的難易程度。某一物質在溶劑中溶解度大小與該物質的分子結構及溶劑理化性質有關，一般遵守“相似相溶”的原則。擴散作用對蛋白質的提取有一定的影響。減小溶劑的黏度、攪拌和延長提取時間可以提高擴散速度，增加提取效果，提取的原則是“少量多次”，即對于等量的提取溶液，分多次提取比一次提取效果好得多。大部分蛋白質都可以溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數與脂類結合的蛋白質則溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中，因此，可采取不同溶劑提取分離和純化蛋白質。

一、水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質的穩定性好，溶解度大，是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1～5倍，提取時需要均勻地攪拌，以利于蛋白質的溶解。提取的溫度視其有效成分的性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此基于這一點考慮，提取蛋白質時一般采用低溫（5℃以下）操作。

為了避免蛋白質提取過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸、碘乙酸等）。

下面著重討論提取液的 pH 和鹽濃度的選擇。

1. pH　蛋白質是具有等電點的兩性電解質，提取液的 pH 應選擇在偏離等電點兩側的 pH 范圍內。用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或者過堿而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆化。一般來說，堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏堿性的提取液提取。

2. 鹽濃度　稀鹽溶液可促進蛋白質的溶解，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量 NaCl等中性鹽，一般以0.15mol/L濃度為宜。緩沖液常采用0.02～0.05mol/L磷酸鹽或碳酸鹽的等滲鹽溶液。

二、有機溶劑提取法

一些和脂類結合比較牢固或者分子中非極性側鏈較多的蛋白質，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮或丁醇等有機溶劑，它們具有一定的親水性，還有較強的親脂性，是理想的提取脂蛋白的提取液，但必須要在低溫下操作。

丁醇提取法對提取一些與脂類結合緊密的蛋白質特別優越，一方面是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；另一方面，丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內不會引起蛋白質的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。

三、蛋白質提取舉例——胰糜蛋白酶的制備

【實驗目的】

掌握從組織中制備胰糜蛋白酶的原理和方法。

【實驗原理】

胰糜蛋白酶是胰腺產生的一種消化酶。最初以酶原的形式被合成與分泌，之后在胰蛋白酶的作用下被水解而激活。胰糜蛋白酶是一種催化肽鍵的肽鏈內切酶，主要切斷色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的羧基側肽鍵。

酶絕大多數都是蛋白質，因此一般提純蛋白質的方法也適用于酶的提純，所不同的是在提純酶的過程中要不斷地進行酶活力的檢測，本實驗主要涉及提取過程。
【實驗藥品與器材】

（一）材料和試劑

1. 主要材料：新鮮豬胰臟1個。

2. 主要試劑

2.5mol/L H2SO4溶液，固體(NH4)2SO4，氯化鈣粉，10％三氯乙酸溶液，1%酪蛋白溶液，）0.1mol/L pH7.4 磷酸鹽緩沖液，1％BaCl2溶液，5mol/L NaOH溶液。

（二）主要器材

組織搗碎機、手術器械、紗布、漏斗、透析袋、離心機、燒杯、pH計、離心管。

【實驗方法與步驟】

1. 提取　取新鮮豬胰臟，放在盛有冰冷2.5mol/L H2SO4溶液的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰臟表面的脂肪和結締組織后，稱重。用組織搗碎機粉碎。然后混懸于兩倍體積的冰冷2.5mol/L H2SO4溶液中，置于冰箱中過夜。將上述混懸液以3000rpm離心10min，上層液經兩層紗布過濾至燒杯中；將沉淀再混懸于等體積的冰冷 2.5mol/L H2SO4溶液中，再離心，將兩次上層液合并，即為提取液。此時可留樣測酶的活力。

2. 分離。

3. 結晶　取分離所得的胰糜蛋白酶溶于3倍體積的水中（此時可取0.5ml留樣測酶活力），加(NH4)2SO4（1.44g/10ml），用5mol/L NaOH溶液調pH至6.0，在室溫放置12h即可出現結晶，在顯微鏡下觀察結晶形狀。

【注意事項】

1. 整個操作過程在0℃～5℃條件下進行。

2. 實驗材料應采用新鮮胰組織。

3. 分清實驗過程中每次離心后各保留的是上清液，還是沉淀。

4. 離子強度、pH、溫度、試管的潔凈度等均可影響酶的活性，如需進一步進行活性測定，務必保證固定的實驗條件，嚴格按照程序操作。