葡萄糖氧化酶（GOD）是一種需氧脫氫酶，屬氧化還原酶，能夠在有氧環境下，專一氧化β-D-葡萄糖為D-葡萄糖酸-δ-內酯和過氧化氫，D-葡萄糖-δ-內酯又以非酶促反應方式自發水解為葡萄糖酸。早期GOD命名為β-D-吡喃葡萄糖氧化酶或β-D-吡喃葡萄糖需氧脫氫酶，后來簡稱為葡萄糖
氧化酶，1961年國際生化協會酶委員會將其系統命名為β-D-葡萄糖，分子式為C6H12O6，歐盟系統編號為EC 1.1.3.4[ 1 ]。
在1904年，人們就發現了GOD，但當時沒有引起足夠的重視[ 2 ]。直到1928年，Muller首先從黑曲霉菌絲體經壓汁處理后的無細胞提取液中發現了GOD，進行了葡萄糖酸形成的酶學研究，并進一步研究了其作用機理。此后Nakamatsu、Fiedurek、Rogalski等先后對GOD做了大量研究工作并投入生產。后來各國學者又相繼在擬青霉屬、膠霉屬及帚霉屬等中也提純出了GOD。20世紀40年代就開始有GOD產品出售。50年代日本獲得了結晶GOD。60 年代日本長賴工業公司也開始有GOD 商品出售。70年代GOD在國外應用已經很廣泛。我國于20世紀70年代開始系統的研究生產GOD，自1986年開始研究GOD的制備提純工入生產。河北省微生物研究所在GOD的制備和應用方面作了許多深入地研究，取得了突破性的進
展，先后制備了診斷用的GOD、食品用GOD等多種劑型，目前已成為GOD專業化生產基地。1999年農業部將其定為12種允許使用的飼料酶制劑添
加劑之一。2013年12月30日農業部發布的《飼料添加劑品種目錄（2013）》中，對我國允許使用的飼料級GOD生產菌株進行了專門的規定，限定為特異青霉和黑曲霉[ 3 ]。經過幾十年的發展，目前GOD在食品和醫藥行業中已得到了廣泛應用，但GOD作為飼料添加劑用于畜牧養殖業中的研究報道相對較少。
1 GOD的酶學性質
高純度GOD為淡黃色粉末，易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、乙二醇和甲酰胺等有機溶劑，50%丙酮、66%甲醇都能使其沉淀，可以被弱酸性的離子交換樹脂及氧化鋁等吸附[ 4 ]。GOD 最大光吸收波長為377 和455 nm，在pH 為2.2~8.4，溫度為20~70 ℃均可起催化作用，其適宜溫度為30~60 ℃，最適pH為5.0~5.6。GOD具有很好的穩定性，不受乙二胺四乙酸、氰化鉀及氟化鈉抑制，但Ag+、Hg+、亞硫酸氫鈉對其有強烈的抑制作用，而Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+對其具有不同程度的激活作用[ 5 ]。固體GOD酶制劑在0 ℃下保存，至少可穩定2年，在-15 ℃下可穩定8年。一般情況下，GOD反應受底物濃度的影響不大，葡萄糖底物濃度在5%~20%時，反應速率幾乎保持不變[ 6 ]。
2 GOD的空間結構
GOD是由兩個完全相同的糖蛋白經二硫鍵共價結合而形成的一個同型二聚體結構，每個糖蛋白單體又含有2個區域：一個與底物β-D-葡萄糖以4個α螺旋支撐一個反向平行的β 折疊形式結合；另一個與部分輔基FAD以非共價的β 折疊的形式緊密結合，GOD空間三維結構模擬圖見圖1。
3 GOD的催化反應特性
3.1 GOD在不同反應條件下的反應過程
GOD的催化反應按反應條件不同有以下3種形式[ 7 ]: （1）無過氧化氫酶存在時：（2）有過氧化氫酶存在時：（3）過氧化氫酶和乙醇同時存在時：
通常情況下，GOD是通過與過氧化氫酶組成一個氧化還原系統發揮作用的。GOD會在有氧環境下氧化β-D-葡萄糖，生成D-葡萄糖酸-δ-內酯，同時產生過氧化氫；過氧化氫酶能夠將生成的過氧化氫分解成水和氧；水再與D-葡萄糖酸-δ-內酯結合產生葡萄糖酸[ 8 ]。葡萄糖氧化酶作用機理見
圖2。
3.2 GOD的催化反應底物特異性
葡萄糖氧化酶具有高度的底物專一性，其對α-D-葡萄糖的催化活性不及β-D-葡萄糖的1%，且對L-葡萄糖完全沒有活性[ 9-10]。GOD在不同底物
條件下的催化速率見附表。
4 GOD的生產
GOD 廣泛地分布于動物、植物和微生物體內，但動植物體內含量甚微且不易提取，而微生物霉菌具有生長繁殖速度快、來源廣泛等特點，使其成為生產GOD的主要來源。工業上一般采用黑曲霉和青霉菌屬菌株作為GOD的生產菌株。另外米曲霉、土曲霉、擬青霉屬、膠霉屬、帚霉屬、鐮刀霉菌及檸檬酸霉屬等也能生產GOD。
4.1 GOD生產菌株
天然菌株產GOD水平較低，難以直接用來生產GOD，工業上通常通過誘變處理及基因工程技術等來篩選、培育高產菌株。誘變育種包括物理誘 變、化學誘變以及多種不同誘變方法的復合誘變等。朱運平等采用紫外誘變、亞硝酸鈉化學誘變以及紫外-亞硝酸鈉復合誘變3種方法對1株產胞外GOD黑曲霉菌株1504進行誘變育種，最終選育出1株產酶活力達到186.32 U·mL-1，為原始菌株酶活力3.8倍的菌株[11]。基因工程育種是一種體外重組DNA技術，即在分子水平上對目的DNA片段進行分子改造或將目的GOD基因連接到特定載體上表達。該方法是一種旨在定向改變菌株遺傳性狀或創造一種新型菌株的育種技術。基因工程技術培育出來的基因工程菌株能夠減少雜蛋白質的分離，后續簡化GOD的分離、純化程序具有重大意義。Crognale等將一株青霉的GOD 基因成功導入畢赤酵母中表達，發酵培養酶活可達到50 U·mL-1[12]。劉虎軍等將GOD目的基因和表達載體pPIC9K連接經電轉化導入畢赤酵母GS115宿主菌中表達，獲得了一株產GOD酶活為25 U·mL-1的菌株[13]。
4.2 GOD生產的發酵工藝
培養基組成、發酵條件的控制及發酵工藝設備等都是直接影響發酵效果的主要因素。碳源和氮源是培養基中對菌種發酵的兩個最基本影響因
素。不同的菌種對碳源有特異的選擇性[14]。一般工業生產中選用葡萄糖作為GOD菌株的碳源，葡萄糖是GOD最主要的誘導物。也有一些霉菌在以蔗糖、麥芽糖、木醇糖、果糖等作為碳源時，其反應也很活躍，Semashko等研究了3個青霉菌的突變菌株funiculosum BIMF-15.3、MM95.132和46.1均能在分別以葡萄糖、木醇糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘油和甘露醇作為碳源的培養基上生長并產生GOD，且在以葡萄糖、蔗糖、果糖為碳源的培養基中GOD 的產量較高， P. funiculosumBIMF-15.3在以木醇糖或甘露醇為碳源時產酶反應活躍，而P. funiculosum 46.1在麥芽糖為碳源時產酶反應活躍[15]。碳源的初始濃度也會影響霉菌GOD的合成。初始碳源濃度約為8%時適宜GOD合成，濃度過低或過高都會降低產酶水平，初始碳源濃度降低，會影響菌體生長；濃度增大，會因代謝產物大量生成而形成阻遏作用[16]。相對于碳源，菌種對氮源的選擇特異性沒有那么嚴格。氮源分為有機氮源和無機氮源，有機氮源包括蛋白胨、玉米漿以及麥芽浸粉等；無機氮源主要為硝酸鹽和銨鹽。研究表明，將無機氮源與有機氮源聯合使用比使用單一氮源效果要好[17]。發酵過程是一個復雜的反應系統，影響因素包括培養基初始pH、接種菌齡與接種量、溫度控
制、發酵時間、搖瓶轉速與溶氧量及鈣離子添加量等。GOD在pH為5~6時具有較好的穩定性，且活力較高，尤其是在pH約為5.5時，酶活達到最
高，pH<4.5或>6.5時，酶活均呈下降趨勢[16]。適宜接種菌齡一般選擇在對數生長期的后期，即培養液中霉菌量接近高峰的時間段內，過早或過遲接種都對菌種的發酵不利。菌種接種量在菌液黏度及溶氧量等條件允許情況下，接種量越大越有利于提高發酵效率，但過大會影響產物的生成。黑曲霉的最適發酵溫度為30~31 ℃，青霉最適發酵溫度較低，為26~29 ℃，且前期霉菌生長所需溫度略高，后期GOD合成所需溫度略低。研究表明，將黑曲霉菌種在25~37 ℃進行產酶培養，培養溫度為30~35 ℃， 尤其在30 ℃為最好， 經多次試驗發現，如果在培養開始15~20 h將溫度固定在30~35 ℃，之后降至30~31 ℃，產GOD量最高，產酶量將增加3~4倍。不同菌種達到最大產酶量的發酵時間各不相同。霉菌是需氧菌，在菌株生長及產酶過程中都需要足夠的溶解氧，但溶解氧也不是越多越好，研究表明，培養基中稍低濃度的溶解氧可以促使高活性的GOD 生成，若溶解氧過高，胞內GOD 的生成速率雖高，但可利用的葡萄糖很快被氧化為葡萄糖酸，幾乎無剩余的葡萄糖和足夠的時間獲得較高活性的酶。酶產量與搖瓶轉速與空氣流量、溶解氧以及菌體耐受程度等因素有關。適宜低濃度的鈣離子對GOD的合成有促進作用[8]。一般在培養基中添加一定量的CaCO3，不溶性的CaCO3不僅可以提供低濃度的鈣離子，還可作為菌株的生長載體。研究表明，控制培養基中CaCO3濃度在約35 g·L-1時，對霉菌發酵產GOD的促進作用最為明顯。發酵工藝設備的設計是否合理也直接影響到發酵效率的高低。在GOD發酵過程中引進一個帶有膜過濾器的外循環系統，結果膜過濾發酵GOD產生速率比分批發酵提高約3倍，且能在較長時間內維持較高的產酶率。
4.3 GOD
霉菌發酵除了產生GOD，還會產生很多其他無用的雜蛋白質，主要是過氧化氫酶、α-淀粉酶、蔗糖酶和其他蛋白質。為了得到活性和純度較
高的GOD，必須對粗GOD產物進行分離、純化。目前，用于GOD提純的方法有層析法、沉淀法、吸附法、結晶法、親和色譜及反向膠束法（RM）等。層析法目前應用得比較多，一般包括粗GOD液的濃縮、鹽析、酶的脫鹽、層析等步驟，即先將粗GOD液進行濃縮，一般通過離心、超濾等步驟來完成，經過濃縮后的粗酶液通過硫酸銨沉淀，將目的蛋白沉淀，同時也能有效除去雜蛋白，鹽析后目的GOD蛋白再經過凝膠柱脫鹽，將酶蛋白和鹽基有效的分開，脫鹽后的酶液再通過層析等手段進一步純化。目前應用廣泛的層析有分子篩層析和纖維素離子交換層析。蘇茉等將由黑曲霉H1-9b菌絲體獲得的GOD粗酶液經DEAE-Sepharose離子交換層析和Superdex-200 凝膠過濾層析， 得到的GOD 純品比活力為30 569.7 U·mg-1， 回收率為30.2%，提純倍數為粗酶的41.4倍[18]。沉淀法通過選擇合適的沉淀劑一步沉淀或分級沉淀將GOD與其他雜蛋白質分離，沉淀劑一般有乙醇、丙酮、硫酸銨、單寧酸等。吸附法是在一定條件下，吸附材料的活性基團與GOD通過疏水基因相互作用而被吸附，而后通過改變緩沖液的濃度和pH，使其與吸附劑解吸附，從而得到純度較高的GOD。