熒光共振能量轉移（FRET）

一、活細胞研究遇到的問題：

蛋白質或其他分子在活細胞內互相結合的時間和地點是了解它們功能的關鍵問題。要回答這一問題，需將蛋白質標上不同的熒光團。但是，光學顯微鏡的分辨率將蛋白質檢測精度限制在大約0.2μm左右。要研究蛋白質成分的相互物理作用，需要高的分辨率。

二、什么是FRET？

FRET就是采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近（1-10 nm）時，將光子能從一個受激發的熒光團（供體）轉移到另一個熒光團（受體）。 采用FRET，可以解決超過光學顯微鏡分辨率限制的分子相對鄰近度問題，來顯示（例如）
（1）二個蛋白質成分間分子相互作用；
（2）一個分子內部（如酶活動能力、DNA/RNA形態）的結構變化；
（3）采用象CFP-YFP Cameleon這樣特別的FRET-工具的離子濃度

CFP受光激發后便發射光                              CFP受光激發后但沒有發射小光。

CFP離YFP的距離大于10nm                         CFP與YFP非常接近（1-10 nm）

YFP沒有受到激發，因此也不發射光              CFP沒有受光激發，但發射光

三、FRET原理

受激發后的熒光團（供體）將受激發的靜能轉移到一個光吸收分子（受體）。這種能的轉移是非放射性的，其主要原因是供體和受體之間的偶極-偶極間的相互作用。通過雙偶極反應，一個處于激發態的供體以非激發方式將能量傳遞給旁邊的受體。 這一理論基于將被激發熒光分子看成振蕩偶極子，能夠和有同一震蕩頻率的另一個偶極子發生能量交換。

只有幾個熒光團對才適合FRET實驗，因為，除了其他必要條件（如偶極子定向、足夠的熒光壽命），供體放射光譜必須將受體的激發光譜重疊起來。已知的FRET對是CFP/YFP、BFP/GFP、GFP/諾丹明、FITC/Cy3

CFP/YFP FRET能量圖:

CFP（供體）受到激發，但是大多數能量不會引起青綠色放射體；而是被傳送到YFP（受體）；因此，所產生的放射體主要是黃色的。

四、FRET的應用

象綠色熒光蛋白質（GFP）這樣的熒光蛋白質（FPs）對FRET實驗非常有吸引力。它們可以以基因方法被融合到有關蛋白質中去并且用細胞表達，使它們成為基因表達和蛋白質在活細胞中本地化的極好報告系統。可以提供不同光譜特性的增強型FP變異。

用青綠色的CFP作供體、黃色的YFP作受體是最適合做活細胞FRET實驗的，因為CFP放射光譜部分重疊了YFP激發光譜。

當它們足夠接近時，用CFP的吸收波長激發，CFP的發色基團將會把能量高效率地共振轉移至YFP的發色基團上，所以CFP的發射熒光將減弱或消失，主要發射將是YFP的熒光。兩個發色基團之間的能量轉換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對空間位置的改變非常靈敏[1-2 ]。例如要研究兩種蛋白質a和b間的相互作用，可以根據FRET原理構建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白質b、 YFP(yellow fluorescent protein)。用CFP吸收波長433nm作為激發波長，實驗靈巧設計，使當蛋白質a與b沒有發生相互作用時，CFP與YFP相距很遠不能發生熒光共振能量轉移，因而檢測到的是CFP的發射波長為476nm的熒光；但當蛋白質a與b發生相互作用時，由于蛋白質b受蛋白質a作用而發生構象變化，使CFP與YFP充分靠近發生熒光共振能量轉移，此時檢測到的就是YFP的發射波長為527nm的熒光(圖1)。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉基因技術使其在細胞內表達，這樣就可以在活細胞生理條件下研究蛋白質－蛋白質間的相互作用。