肺細胞PCR基因擴增原理及方法步驟

發布時間：2019-03-02 16:14 原文鏈接：肺細胞PCR基因擴增原理及方法步驟

實驗概要

PCR擴增目標DNA片段。

實驗原理

多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火、延伸三個基本反應步驟構成。

1. 模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

2. 模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

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3. 引物的延伸：DNA模板－引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性、退火、延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴增的目的基因擴增放大幾百萬倍。

典型的PCR反應體系由如下組分組成：DNA模板、反應緩沖液、dNTP、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱 Taq聚合酶。

除了典型的PCR外，人們還根據各種用途設計了各種不同的PCR。如：

RT-PCR，即在mRNA反轉錄之后進行的PCR。

反向PCR，常規PCR允許擴增兩引物之間的DNA區段，而反向PCR則可以對靶DNA區段之外的兩側未知的DNA序列進行擴增。

不對稱PCR，常規PCR使用的引物濃度相同，而不對稱PCR使用的引物濃度不同，兩種引物濃度相差100倍。在zui初20各循環中，主要產物是雙鏈DNA。當低濃度引物被耗盡后，高濃度引物引導的PCR就會產生大量單鏈DNA，單鏈DNA可用于序列測定。