聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆（二）

二、PCR反應參數

1、變性：在第一輪循環前，在94℃下變性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使PCR失敗，因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復性，減少DNA產量.一般變性溫度與時間為94℃ 1min。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時間主要是為使反應體系完全達到適當的溫度。對于富含GC的序列，可適當提高變性溫度。但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。

2、退火：引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度.實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5℃。一般當引物中GC含量高，長度長并與模板完全配對時， 應提高退火溫度。退火溫度越高， 所得產物的特異性越高。有些反應甚至可將退火與延伸兩步合并，只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個擴增循環， 既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數秒鐘即可完成，反應中所需時間主要是為使整個反應體系達到合適的溫度。通常退火溫度和時間為37℃-55℃，1-2min。

3、延伸：延伸反應通常為72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最適反應溫度75℃。實際上，引物延伸在退火時即已開始，因為Taq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應時間的長短取決于目的序列的長度和濃度.在一般反應體系中，Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。延伸時間過長會導致產物非特異性增加.但對很低濃度的目的序列， 則可適當增加延伸反應的時間。一般在擴增反應完成后，都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應，以獲得盡可能完整的產物， 這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。

4、循環次數： 當其它參數確定之后， 循環次數主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環已經足夠。循環次數過多，會使PCR產物中非特異性產物大量增加。通常經25-30輪循環擴增后， 反應中Taq DNA聚合酶已經不足， 如果此時產物量仍不夠， 需要進一步擴增， 可將擴增的DNA樣品稀釋10³-10⁵倍作為模板， 重新加入各種反應底物進行擴增， 這樣經60輪循環后， 擴增水平可達10⁹-10¹⁰ 。

擴增產物的量還與擴增效率有關，擴增產物的量可用下列公式表示：C＝C0 (1+P)ⁿ 。其中：C為擴增產物量，C0 為起始DNA量， P為增效率， n為循環次數。

在擴增后期，由于產物積累，使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線，產物不再隨循環數而明顯上升，這稱為平臺效應。平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。

三、PCR產物的克隆

在許多研究中，需要將PCR產物克隆，以獲得目的DNA片段。此時，所用PCR循環數應盡量小，以減少平臺效應或非特異性擴增產物的干擾。通常將PCR產物插入到載體中有下列一些方法。

1、 平末端連接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR產物3'端加上多余的非模板依賴堿基，在用平末端連接克隆PCR產物前，可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶處理補平末端。

2、在PCR產物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶會在3'端加上多余的非模板依賴堿基，而且對A優先聚合，所以PCR產物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點，可以經限制酶切割產生的平末端用酶加上dT或ddT，使載體與PCR產物末端互補并進行連接.載體末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP，ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵，保證在載體3'端只加上一個ddTTP，而其5'端所含的磷酸基團可與PCR產物的3'端OH連接，連接產物在載體和PCR產物之間的雙鏈上帶兩個切口，這種重組DNA仍可轉化合適的受體菌，并在細菌體內修復.目前一些公司已開發出可直接用于克隆PCR產物的帶3'-T的T-Vector。

3、粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點，直接將PCR產物經適當的限制酶切割后產生粘性末端，與載體連接，產生重組DNA.如果下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點.經酶切后定向克隆到載體中。