聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳

實驗概要

本實驗介紹了血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳的原理、試劑配制、操作步驟及注意事項等。

實驗原理

本實驗利用聚烯酰胺凝膠作電泳支持物。電荷和分子大小不一的各種血清蛋白質通過濃縮效應、電荷效應、分子篩效應而被精細地分離。由于具有以上三種效應，所以此方法分離效果好，分辨率高。血清蛋白在醋酸纖維素薄膜電泳僅能分成5~7個組份，而在聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳中可分出12~30個組份。

主要試劑

試劑

凝膠溶液配制表

附注：凝膠聚合速度受溫度影響較大，溫度低時，聚合速度減慢，需適當調整3號及4號試劑的用量，達到在30分鐘左右聚合。

主要設備

1. 園盤電泳槽

2. 電泳儀

3. 玻管(10×15px)

4. 50μl微量注射器、5ml注射器

5. 250px長的局麻針頭、18號針頭

6. 長細滴管

7. 小澆杯

8. 橡皮管、吸耳球等

實驗材料

血清蛋白

實驗步驟

1. 凝膠柱的制備：

   1) 取已準備好的10×15px的玻管，從一端量至175px處，用玻璃臘筆劃線。起始端用膠布包封好后，插入橡皮塞中，垂直放好。

   2) 分離膠的制備：

       a.  按分離膠配制表的比例(附后)，取1號、2號試劑和蒸餾水加入一小燒杯中，混合后，再加入3號和4號試劑，混勻后即成為分離膠溶液(此溶液約在半小時內聚合為聚丙烯酰胺凝膠，故應盡快操作。如室溫較高時，為防止過快聚合，可放置冰浴中操作。或根據聚合速度的快慢，適當調整TEMED的加入量)。

      b. 用5ml注射器、18號針頭或用長細滴管吸取分離膠溶液，將其沿玻管管壁注入玻管，直至175px劃線平面。

      c. 用長細滴管吸取蒸餾水，沿管壁在分離膠的液面上加注12.5px高的水層。加水時必須緩慢細流，盡量減少膠液表面的震動與混合。(加注水層是為了使凝膠聚合后的表面平整而不致出現彎月形，并能使凝膠與空氣隔絕。這一步很重要，它將直接影響分辨率與帶形)。

      d. 將加注好的凝膠管靜置1小時，以進行聚合反應。在聚合過程中，起初凝膠與水層的界面逐漸消失，待膠體形成后，其界面又將重新可辨。這一現象可用來觀察判斷凝膠的聚合是否完成。

   3) 濃縮膠的制備

      a. 按濃縮膠配制表的比例取2號、5號試劑和蒸餾水加入另一小燒杯中，混合后，再加入3號和4號試劑，混勻后即成為濃縮膠溶液。(在制備濃縮膠時，也常用核黃素催化的光聚合來代替過硫酸銨催化的化學聚合作用)。

      b. 用滴管和濾紙小心地吸去已聚合好的分離膠膠面上的水液。注意切勿觸及膠面。

      c. 用長細滴管或注射器吸取濃縮膠溶液，在分離膠膠面上沿玻管壁小地注入0.5~25px高的膠液。然后同樣沿玻管壁緩慢細流地加入12.5px高的蒸餾水。靜置一小時后即可使用。

在加樣之前先用滴管或濾紙小心地吸去濃縮膠膠面上的水液。

2. 加樣：

用50μl的微量注射器，取12μl血清，加12μl的40%蔗糖溶液(1∶1稀釋)，再加入40μl0.05%溴酚蘭指示劑，混勻。每管中加入該混合液16μl，共可加4管。每管實際加入純血清3μl，含蛋白質196μg。(血清蛋白質含量為6.2克/100毫升血清)

若需增減管數，亦照此加樣比例推算。

3. 電泳

   1) 將加樣完畢的凝膠管上端垂直插入上電極槽底板的橡膠塞孔中。并去掉下端的橡皮塞和膠布。

    2)  先用長細滴管吸取電極緩沖液，在已插好的凝膠管樣品液面上，小心地逐管加滿電極緩沖液。然后將電極緩沖液慢慢地倒入上、下電極槽中。注意避免和排除凝膠管的上、下管口內留有氣泡，否則會影響導電。電極緩沖液的加入量，上槽以電極能完全浸入為宜，下槽以凝膠管浸入3/5為宜。

   3) 將上槽的電極接電泳儀的負極，下槽的電極接電泳儀的正極。先調節電流為1mA/管，待示蹤染料進入分離膠后，再調節電流為2~3mA/管。待示蹤染料遷移至距管下口12.5px時，切斷電源，電泳完畢。

4. 剝膠

取下凝膠管，用帶250px長針頭的注射器吸取蒸餾水作潤滑針。將針頭小心插入管壁與膠柱之間，一邊注水，一邊使針頭緊貼管壁慢慢呈螺旋式前進。如果一頭不行，再在另一頭按同樣的方法剝離，直至膠柱與管壁分開，從玻管中滑出。如膠柱不能滑出，可用洗耳球從一端加壓吹出。

5. 固定、染色及漂洗：

將剝出的膠柱浸入8號試劑60℃水浴30-60分鐘，進行染色，然后用清水沖洗掉多余的染料。

注意事項

1. 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯胺是神經性毒劑，并對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。大量操作時應在通風櫥中進行。

2. 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺溶液應裝在棕色瓶中，置冰箱內(4℃)保存。可貯存1~2月。測定pH值(4.9~5.2)可檢查其是否失效。失效液不能聚合。

3. TEMED要密封保存，過硫酸銨溶液最好當天配制，以防止氧化失效。

4. 凝膠的聚合速度與溫度關系很大，必須根據實驗時的溫度調整3號、4號試劑的用量，以使凝膠在30分鐘內聚合。