實驗方法原理 在大腸桿菌細胞內,F因子與染色體DNA之間的交換可使F因子插入到宿主細胞的染色體DNA中。帶有一個整合F因子的細胞稱為高頻重組(Hfr)細胞。不同的Hfr菌株中F因子的整合的位置不盡相同。在Hfr細菌和F-接合中,Hfr細胞染色體可以進入F-細胞,發生重組。Hfr細菌中染色體的轉移從F因子的末端開始,而且在轉移的過程中可隨時發生中斷。因此,接合后的F-細菌雖然接受了某些Hfr基因,但是一般不能接受F因子使之成為Hfr或F+狀態。由于染色體的轉移具有方向性并且隨時中斷,處在前端的Hfr基因有更多的機會出現在F-細菌中,越位于后端的基因轉入F-細胞的機會越少。因此,根據接合后F-細菌中Hfr基因出現的多少(即重組子的多少)便可以知道這些基因轉移的先后順序。由此可見,可以通過梯度轉移方法測定基因在染色體上的相對位置,即基因在染色體上的排列順序。
實驗材料 供體菌 : 大腸桿菌 ( Escherichia coli) CSH60: Hfr sup 受體菌 : 大腸桿菌 ( E . coli) FD1004: F - leu purE trp his met A ilv arg thi ara lacY x yl m tl gal T6 r rif r strr
試劑、試劑盒 LB培養液A～D固體基本培養基(每組選用一種6皿)半固體瓊脂無菌生理鹽水
儀器、耗材 恒溫培養箱 振蕩混合器 高壓滅菌鍋 培養皿 三角瓶 移液管 試管
實驗步驟
1.分別將供體菌和受體菌接種在5ml LB液體中,37℃振蕩培養過夜。
2.將培養過夜的供體菌和受體菌各按1∶5的比例轉入另外稀釋的5ml LB液中,37℃繼續培養2～3h。
3.分別取0.2ml供體菌和4ml受體菌混合在一個150ml無菌三角瓶中,置37℃水浴輕輕搖動(50～100r/min)。
4.分別在培養0min、10min、20min、30min、40min、50min時將上述混合菌液吸0.2ml于盛有10ml無菌生理鹽水大試管中,立即用振蕩混合器劇烈振蕩30s,然后取0.2ml于3ml半固體培養基中用振蕩混合器混合5s,倒在選擇平板上鋪平(每個實驗小組可選用其中一種選擇性培養基),同時取供體菌和受體菌作為對照(以后取樣測定不需要再做對照),待凝固后置37℃培養過夜。