（1）融合：細胞雜交之前，要分別準備好脾臟的B細胞懸液和小鼠骨髓瘤細胞（如SP2/0—Agl4細胞株）。免疫后的小鼠脾臟在無菌條件下破碎，將B細胞懸浮在沒有血清的培養液中（通常使用RPMIl640商品配制），并洗滌3次去掉小鼠的血清。SP2/0細胞是用加有10%胎牛或小牛血清培養的，每天更換新鮮培養液使成為對數分裂期生長旺盛的細胞。細胞用RPMIl640洗滌2—3次，把兩種細胞合并在同—試管中，用50%的聚乙二醇（相對分子質量為1000—1500）作為融合劑，在37℃條件下融合l—2min。然后用1640培養液緩慢稀釋，然后除去PEG，將細胞分散至HAT選擇培養板中。電融合方法也可用于單克隆抗體制備，雖融合率較高，但一次融合的細胞數少，且需專門設備，故限制了其廣泛使用。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例在5：1—10：1均可獲得滿意結果，每次融合細胞數量在10—10較為合適。融合后的細胞在40或96孔板上的HAT培養液(RPMIl640含10%—20%胎牛或小牛血清和HAT）中37℃，5%CO2條件下培養。融合后的細胞懸液中只有脾細胞和骨髓瘤細胞形成的雜交瘤細胞能在HAT培養基中生長，其他形式的融合細胞均不能生長．未融合的細胞也不能在HAT培養液中生存。
在融合后的細胞培養過程中，飼養細胞（feeder cell）有助于雜交瘤細胞的生長。飼養細胞可用同種動物的腹腔細胞或胸腹細胞。腹腔細胞中的吞噬細胞能清除死亡細胞碎片。使背景更為清潔“干凈”。同時飼養細胞分泌的細胞因子或活性物質有助于雜交瘤細胞的生長。現有商品“雜交瘤細胞生長因子”可用于替代飼養細胞。
（2）陽性雜交瘤細胞的篩選與單克降化：雜交細胞經約10—14d培養后，形成可用的細胞集落（克隆）。經過幾次更換培養液（HT培養液）后進行抗體活性檢測。常用的篩選槍測方法是ELISA和凝集試驗，前者常用于可溶性抗原，后者適用于細胞、細菌等表面抗原。此外，Dot－ELISA、免疫印跡及免疫熒光試驗均可用于雜交瘤細胞的篩選。
使許多細胞克隆混合生長的細胞分離為單個的細胞克隆的過程稱克隆化（colonization）最常用的單克隆化方法是有限稀釋法（limited dilution），即將混合細胞經稀釋后分裝于培養板上，使培養板的大部分孔中只出現一個細胞。為了確保抗體分泌細胞來源于單個細胞，克隆化過程可重復進行，稱為亞克隆化（subclonization）。除有限稀釋法外，熒光激活細胞分揀法（FACS）也用于雜交瘤細胞的克隆化過程。