細胞支原體污染原因、來源及預防措施3

測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培養液接種于指示細胞培養液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培養指示細胞再作螢光染色。正負反應對照組亦可以接種于indicator cell內作為對照。
·待測細胞亦可作直接測試，但需為吸附型細胞，培養后直接作螢光染色。有些細胞易有螢光背景，而干擾結果判讀，則建議使用接種于指示細胞之步驟。
·特點︰簡單、經濟與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟。可以偵測不易培養之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養法快，約一星期即可知道結果。
·缺點：有時仍會有螢光背景，影響判讀。
材料︰
·Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內放置無菌22x22mm蓋玻片﹙浸于酒精內，使用前過火滅菌﹚，一般吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片，細胞面朝下放在玻片上觀察。
·Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，細胞須先測試無污染。αMEM with 10%FBS ( medium for Vero cell)
配制試劑:
·無菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。
·Hoechst 33258 stock solution（100X）︰稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20℃。

·Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4℃。
·mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH調整pH至5.5（pH很重要），貯存于4℃。
·固定溶液（fixative）︰冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例混合，使用前才配制。
步驟：
·培養Vero細胞： Vero細胞可作長期培養或制作多個冷凍保存管，測試前解凍培養。測試前一周培養Vero細胞。
·在接種測試樣品前一日，以 trypsin-EDTA溶液處理Vero細胞，制成細胞懸浮液，以1~2x10^4 cells／ml培養于chamber slide中，每個well加入1ml細胞懸浮液，于37℃, 5％CO2培養。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品。

·接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養基，1ml待測細胞培養液（可將細胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷凍管之細胞懸浮液。
·將測試樣品加入chamber slide內，培養5天后，進行Hoechst 33258的螢光染色觀察。
·以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細胞作為正反應對照組﹙或是已感染支原體之細胞培養液或冷凍細胞液﹚，負反應對照組為Vero cell之新鮮培養基( αMEM +10%FBS)。
DNA螢光染色檢測︰
·取出培養5日之Vero細胞，吸除培養液。于每個well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液。重復上述之步驟，風干10分鐘。
·于每個well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30 min。
·吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗滌3次，風干后加入1滴的mounting solution，并以蓋玻片覆蓋之。
·以100x-400x螢光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后，以UV激發光束(330～380 nm)之濾光鏡，觀察細胞核外是否有藍色螢光小點或是絲狀點之螢光物產生。
結果判讀︰
若有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點或是絲狀點。其形狀一致，與細胞殘片染成之不規則點狀物不同。其螢光可維持數星期。
圖例 (A)為negative result : 螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細胞的細胞核，測試樣品沒有支原體的污染。(為positive result : 在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點和絲狀點，表示測試樣品有支原體的污染。