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  • 發布時間:2019-11-03 18:38 原文鏈接: 細胞培養大攻略7

    62、貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基,在放置幾天后顏色變紫?
     

    這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時,碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口,在CO2培養箱孵育培養基10-15分鐘,來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。
     

    63、 細胞培養基偶然被凍,可否繼續使用?
     

    如果細胞培養基偶然被凍,您應該熔化培養基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生,培養基可以正常使用,如果出現沉淀,只能丟棄這些培養基。


    64、無血清培養與有血清培養使用的抗生素量一樣嗎?
     

    當在無血清培養基中添加抗生素時,降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下,抗生素不被滅活,可能對于細胞達到毒性水平。


    65、培養基中添加了血清和抗生素后,可長期保存嗎?
     

    一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
     

    66、培養基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎?
     

    大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會影響它的性能。
     

    67、為什么要在溶解的一周內使用貯存在4 ℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?
     

    胰蛋白酶在4 ℃就可能開始降解,如果在室溫下放置超過30分鐘,就會變得不穩定。
     

    68、保存血清最好的方法?
     

    我們建議血清應保存在-5 ℃至-20 ℃。若存放于4 ℃時,請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶,建議無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內,再放回冷凍。
     

    69、如何解凍血清才不會使產品質量受損?
     

    將血清從冷凍箱取出后,先置于2~8 ℃冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過程中必須規則地搖晃均勻。
     

    70、 血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現,該如何處理?
     

    血清中沉淀物的出現有許多種原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后,也會存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物,并不影響血清本身的質量。
     

    若欲去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝至無菌離心管內,以400 g稍微離心,上清液即可接著加入培養基內一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物,因為它可能會阻塞過濾膜。
     

    71、為什么要熱滅活血清?
     

    加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究,培養ES細胞、平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。
     

    72、有必要做熱滅活嗎?
     

    實驗顯示,經過正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進,或完全沒有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量,而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清,沉淀物的形成會顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點”,常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37 ℃環境中,又會使此沉淀物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。
     

    若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節省時間,更確保血清的質量。
     

    73、為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀?

    有些胎牛血清產品沒有預老化,儲存在2-8 ℃時,血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在-20 ℃儲存胎牛血清,避免反復凍融。
     

    74、如何避免沉淀物的產生?
     

    我們建議您在使用血清的時候,注意下列的操作:
     

    (1)解凍血清時,請按照所建議的逐步解凍法(-20 ℃至4 ℃至室溫),若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37 ℃),非常容易產生沉淀物。
     

    (2)解凍血清時,請隨時將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發生。
     

    (3)請勿將血清置于37 ℃太久。若在37 ℃放置太久,血清會變得混濁,同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害,而影響血清的質量。
     

    (4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無須做此步驟。
     

    (5)若必須做血清的熱滅活,請遵守56 ℃,30分鐘的原則,并且隨時搖晃均勻。溫度過高,時間過久或搖晃不均勻,都會造成沉淀物的增多。

    75、 液體培養基的保存是冷藏好?還是冷凍好?
     

    要冷藏!因為液體培養基經冷凍后再經溶化時,其溶液的pH值會發生改變,溶液往往變堿,某些成分溶解也會受到影響對細胞生長不利。故液體培養基一定要存放在冷藏箱中,通常液體培養基在冷藏條件下可存放6個月 ~ 一年。
     

    76、 液體培養基中谷氨酰胺的作用,及使用方法。
     

    幾乎所有的細胞對谷氨酰胺有較高的要求,細胞需要谷氨酰胺合成蛋白質,在缺少谷氨酰胺時,細胞生長不良而死亡。所以,各種培養液中都含有較大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不穩定,應置-20 ℃冰凍保存,用前加入培養基中。加有谷氨酰胺的液體培養基4 ℃冰箱儲存兩周以上時,應重新加入原來量的谷氨酰胺。基礎醫學細胞中心在其服務項目中配制分裝了高濃度(100倍)的谷氨酰胺溶液(1 ml/支)。每支1 ml的谷氨酰胺加到99 ml完全培養基中,其終濃度為2 mM/ml培養基。包裝為粉紅色,-24 ℃保存。

     

    77、培養用液pH對細胞生長的影響
     

    由于,大多數細胞適宜pH為7.2~7.4,偏離此范圍對細胞將產生有害的影響。各種細胞對pH的要求也不完全相同,原代培養細胞一般對pH變動耐受差,無限細胞系耐受力強。
     

    但總體來說,細胞耐酸性比耐堿性強一些,偏酸環境中更利于細胞生長。因此,我們在配制培養用液時,可把液體的pH稍微調得偏酸一些。液體在經過0.10 um或0.22 um濾膜過濾時,溶液的pH還會向上浮動0.2左右。
     

    78、常用培養基及培養用液的滲透壓范圍
     

    培養基名稱                滲透壓范圍(mOSM)

    DMEM(高糖)              315 ~ 350

    DMEM(低糖)              270 ~ 330

    RPMI-1640                     260 ~ 290

    MEM-EBSS                     280 ~ 310

    MEM-NEAA                     280 ~ 310

    McCoy5a                        280 ~ 310

    MEM-a                             280 ~ 310

    M-199                              275 ~ 305

    IMDM                               270 ~ 300

    DMEM/F-12                    280 ~ 310

    F-10                                 270 ~ 300

    F-12                                 275 ~ 300

    培養基名稱                 滲透壓范圍(mOSM)

    L-15                                280 ~ 320

    D-Hanks                        280 ~ 300

    Hanks                            280 ~ 300

    PBS                                275 ~ 300


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