細胞的原代培養實驗

原代培養是直接從生物體獲取細胞進行培養，由于細胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內的生活狀態。這一方法可為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段，同時也為以后傳代培養創造條件。最常用的原代培養有組織塊培養和分散細胞培養。組織塊培養是將剪碎的組織塊直接移植在培養瓶壁上，加入培養基后進行培養。分散細胞培養則是將組織塊用機械法或化學法使細胞分散。從胎兒或新生兒的組織分離到活性最好的游離細胞，經典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和膠原酶)消化細胞間的結合物，或用金屬離子螯合劑(如EDTA)除去細胞互相粘著所依賴的Ca²⁺，再經機械輕度振蕩，使之成為單細胞。

孕鼠(胚胎小鼠)新生1～3天乳鼠

1640培養液PBS胰蛋白酶EDTA混合消化液乙醇

手術器械平皿培養瓶吸管離心管煤氣燈燒杯超凈工作臺二氧化碳培養箱倒置顯微鏡

1.  取材
 

用頸椎脫位法使胎大鼠迅速死亡。然后，把整個動物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟，置于無菌平皿中。

2.  切割
 

用滅菌的PBS 液將取出的臟器清洗三次，然后用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎，直到成1 mm³ 左右的小塊，再用PBS 清洗，洗到組織塊發白為止。移入無菌離心管中，靜置數分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。

3.  消化、接種培養
 

吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA 混合消化液1 ml，加入離心管中，與組織塊混勻后，加上管口塞子，37 ℃水浴中消化8～10 分鐘，每隔幾分鐘搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10 ml 含10％小牛血清的1640 培養基，用吸管吹打混勻，移入二個培養瓶中，置于二氧化碳培養箱中培養。

1. 嚴格進行動物皮膚消毒．使用三套器械取材。新生動物皮膚先用2％碘酊液消毒，成年鼠先用3％～5％碘酊液消毒后用75％乙醇消毒。

2. 嚴格進行無菌操作，防止細菌、真菌、支原體污染，避免化學物質污染。

3. 吸取液體前，瓶口和吸管進行火焰消毒；經火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷卻。防止燙傷、燙死細胞。吸取液體時，避免瓶口和吸管接觸碰撞。

4. 離心管入臺前，管口、管壁應消毒。

來源《中國醫科大學實驗指導手冊》《分子生物學實驗指導》