細胞凋亡及其檢測技術3

2、RT-PCR法檢測細胞bcl-2 mRNA的表達：
（1）總RNA提取：
為了獲得高質量的真核細胞mRNA，必須使用RNA酶抑制劑。操作過程中應避免RNA酶污染器材和試劑，因此所有剝離、塑料器材先用0.1%DEPC水溶液浸泡12h，然后用無菌的新鮮蒸餾水淋洗數次，塑料器材應采用高壓蒸汽滅菌。玻璃器材應于180℃干烤4-6h，所有溶液配制用水均用已滅菌的新鮮蒸餾水配制，所用試劑要新開封的試劑，或無菌分裝至已處理的容器中，操作時應戴60Co輻照的一次性手套，并勤換，以避免環境中和操作時的RNA酶污染。提取總RNA，采用異硫氰酸胍一步提取法即可。
收集藥物處理和對照組的腫瘤細胞，用PBS洗2次，冷藏5min。
加入變性液Solution D 1ml。
用4號針頭抽打混勻，再加入0.1ml的3mol/L乙酸鈉充分混勻，加80%飽和酚1ml，氯仿/異戊醇0.2ml，混勻后置冰上15min。
于4℃、12000r/min離心5min，取上清移入另一潔凈的塑料離心管中，加2.5倍體積的無水乙醇于-20℃過夜。

次日以4℃、12000r/min離心30min，棄上清，用70%預冷乙醇洗2次，干燥10min，加100ulDEP 水溶解RNA，再加入300ul變性液Solution D混合，再加2.5倍乙醇，-20℃放2h。
用70%預冷乙醇洗2次，加 EDPC水溶解，紫外分光光度計測OD260值、OD280值。當OD260/OD280在1.8-2之間時，RNA純度較好。
（2）RT-PCR：
合成cDNA第一鏈。
各組取5ugRNA進行逆轉錄，反應體系共20ul：
a、5X逆轉錄緩沖液5ul；
b、DTT 1ul；
c、dNTP 2ul；
d、Rnasin 1.5ul；
e、Oligo dT 2ul
f、m-MLV 逆轉錄酶 2ul；
g、RNA樣本 5ug
h、DEPC水補充加至20ul。
上述組分充分混合后，現在室溫作用10min，后在42℃反應1h，經95深深地10min，立即置冰浴冷卻至4℃，逆轉錄產物即cDNA第一鏈于-20℃凍存備用。
PCR反應擴增cDNA
a、P1上鏈，5/-GGTGCCACCTGTGGTCCACCTG-3/;
b、P2下鏈，5/-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3/.
外參照物β-actin的引物序列如下：
a、P3鏈，5/-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3
b、P4鏈，5/-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3/
擴增的產物長度分別為459bp，339bp。
以逆轉錄產物為模板分別與bcl-2引物，β-actin引物混合，反應體系共有50ul；
a、雙蒸水32.5ul；
b、10 x 緩沖液5ul；
c、MgCl2 5ul；
d、dNTP 1ul；
e、P1/P3 0.5ul；
f、P2/P4 0.5ul；
g、TaqDNA 多聚酶0.5ul；
h、cDNA樣品9逆轉錄產物）5ul。
擴增條件：94℃預變性7min，設計PCR循環程序，94℃變性60s，55℃復性50s，72℃延伸60s，共30個循環周期，然后72℃延伸5min，4℃保存備用，并供凝膠電泳。
每組取PCR擴增產物8ul在TBE緩沖液中進行瓊脂糖凝膠電泳（2%）。電壓80V，電泳40min，紫外透射儀下觀察電泳條帶，其熒光帶亮度可隨凋亡的程度而有變化，證明bcl-2基因表達與不同劑量化療藥物作用時間有關，bcl-2基因表達與細胞凋亡呈劑量、時間依賴性。

六、JAM檢測技術
JAM檢測技術是用于測定細胞死亡或凋亡的方法，如51Cr稀放法事基于細胞死亡往往伴隨有細胞膜破裂及細胞質的釋放，用51Cr或125I標記相關的靶細胞，與效應細胞共培養一定時間后，測定一定體積的培養上清中的放射性計數，以反映細胞損傷情況。而人們發現，細胞死亡的早期反應，細胞內DNA被酶裂解成180kb左右的小片段，這一變化發生在細胞膜破裂之前，因而在由CTL介導的細胞死亡早期，靶細胞首先表現為出現DNA碎片。檢測出靶細胞的DNA碎片，對于CTL介導的細胞死亡應是一個更為靈敏、準確的方法。Duke等人曾用差異離心的方法進行檢測，但這一方法比較費時，不適合應用于較大樣品量的常規檢測。而Matzinger發現，可以用3H-TdR標記檢測細胞增殖的方法加以改進來檢測。
（一）檢測原理：
用真空抽吸玻璃纖維濾紙上被3H-TdR標記的靶細胞，以測定靶細胞DNA斷裂及細胞死亡。由于DNA被抽吸的過程中，DNA碎片可以通過抽吸穿過濾膜，因此只有來自于活細胞的完整的DNA被留在濾膜上，通過測定其cpm讀數，即可了解細胞DNA被損傷的程度以及細胞死亡情況。
（二）實驗方法：
1、靶細胞的培養及標記：
靶細胞（通常為腫瘤細胞如P815），通常在培養瓶中，用適宜的培養基，37℃、5% CO2條件下培養，實驗前1天將其按（2.5-5）×105個/ml的濃度接種至24孔板中，培養1天后，向培養基中加入3H-TdR進行標記，使終濃度為2.5-5uCi/ml，不要攪動細胞，在37℃、5% CO2條件下繼續培養一定時間，直至使用前。對于生長較快的靶細胞，培養4-6h即可標記，一般則培養過夜。
2、效應細胞的培養：
常規分離獲得的C57BL/6大鼠脾細胞，按4×106個/空接種于24孔板中，以300Gy照射過的BALB/C大鼠脾細胞作為刺激細胞，培養5天后，于測試前將細胞收集按一定細胞數重新接種于96孔板中，100ul/孔，并進行一定稀釋以達不同的效/靶比（R/T），每組至少設3個平行孔。
3、效應細胞、靶細胞作用：
靶細胞標記結束后，輕輕地將細胞吸出，洗滌1次，再按1×105個/ml濃度重懸，向已含有效應細胞的96孔板中加入100ul/孔的靶細胞，在37℃、5% CO2條件下共同孵育1-4h。
4、收獲：
培養結束后，可用目前收集細胞用的細胞收集器將細胞及其培養基抽吸到玻璃纖維濾膜上，依次用雙蒸水。三氯醋酸、無水乙醇洗滌及固定濾膜，烘干后，加入閃爍液，用液閃計算儀進行測定。
5、計算特異性殺傷率（%）：
特異性DNA殺傷率（%）=[（S-E）/S]×100%。