實驗概要
掌握考馬斯亮藍R250 染細胞骨架微絲的方法，了解動物細胞骨架的基本形態結構。
實驗原理
真核細胞胞質中縱橫交錯的纖維網稱為細胞骨架(cytoskeleton)。根據纖維直徑、組成成分和組裝結構的不同，分為微管(microtubule, MT)、微絲(microfilament, MF) 和中間纖維(intermediate filament, IF)。微絲是肌動蛋白構成的纖維(F-action)。單根微絲直徑約7nm，在光學顯微鏡下看不到。本實驗用考馬斯亮藍R250(Coomassie brilliant blue, R250)顯示微絲組成的應力纖維。應力纖維在體外培養的貼壁細胞中尤為發達，形態長而直，常與細胞的長軸平行并貫穿細胞全長。細胞松弛素B 可與微絲的亞單位肌動蛋白結合，從而破壞微絲，改變細胞的形狀。考馬斯亮藍R250 可以染各種蛋白，并非特異染微絲。但在該實驗條件下，微管結構不穩定，有些類型的纖維太細，光鏡下無法分辨。因此，我們看到的主要是由微絲組成的應力纖維。
主要試劑
1. PBS(pH7 .2)
2. 2%Triton X-100 液
3. M-緩沖液
4. 3%戊二醛固定液
5. 0.2%考馬斯亮藍染液
6. 100μL/mL 的細胞松弛素B
7. DEME 培養液
主要設備
1. 光學顯微鏡
2. 鑷子
3. 小平皿
4. 載片
5. 吸水紙
6. 37℃恒溫箱
實驗材料
蓋片培養的成纖維細胞C6 三片。
實驗步驟
1. 成纖維細胞微絲的染色
1) 在平皿中用蓋片培養C6 成纖維細胞。
2) 將蓋片放入盛有PBS 的平皿內用吸管輕輕吹洗蓋片，換液三次，每次3min，洗去培養液。
3) 將蓋片移入2%Triton X-100 液，置37℃恒溫箱內處理20~30min。M-緩沖液有穩定細胞骨架的作用。
4) 立刻將蓋片移入M-緩沖液，換洗三次，每次3min。
5) 將蓋片移入3%戊二醛固定5min。
6) 將蓋片移入0.2%考馬斯亮藍染液染液中，染色15min。然后小心的用自來水沖洗，空氣干燥。
2. 成纖維細胞微絲對細胞松弛素B 的反應
1) 在平皿中有三張成纖維細胞貼壁生長的蓋片，在超凈工作臺內將一張蓋片移入另一平皿中繼續培養，用作對照。
2) 在有兩片的平皿內加100μL/mL 的細胞松弛素B 4 滴繼續培養半h。
3) 將用細胞松弛素B 處理過的兩張蓋片取一張做染色處理，另一張用培養液洗五次(在平皿內換5 次培養液，每次都要搖動)，繼續培養觀察。2h 后細胞形態恢復，接近正常。
4) 對恢復的蓋片與第一張沒用藥的蓋片一同做染色處理。
注意事項
1. 洗片時要輕柔，以免把細胞從載片上洗去。
2. 恢復時間要足夠，否則細胞不會恢復到未處理前的情況。
3. 細胞蓋片注意正反面。
4. 染色后應沖洗蓋片背面，避免損傷細胞。